芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

为了提高β-甘露聚糖酶的活性及稳定性,通过基因克隆技术克隆并表达了一株分离自椰果的内生枯草芽孢杆菌YZ-21(Bacillus subtilis YZ-21)β-甘露聚糖酶基因ManA,并使用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定了酶活性及稳定性。结果表明：β-甘露聚糖酶基因ManA序列全长1 104 bp,与相同来源的β-甘露聚糖酶同源性高达97.56%,具有ManA保守结构域,符合糖苷水解酶家族GH26的典型特征。将ManA连接到pET-32a表达载体上,构建重组表达质粒pET-ManA,并导入大肠杆菌BL21(DE),经诱导获得了β-甘露聚糖酶基因ManA的高效表达。表达产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分析,显示条带大小约为56.07 ku。重组酶活性为372.86 U/mL,酶学性质研究发现其最适反应温度为40℃,最适pH为7.0,最佳反应底物是瓜豆胶,酶活性能够达到392.54 U/mL。在55℃处理120 min后,酶活仍保留69.8%,pH为4.0～9.0时处理30 min后酶活性均能保留60%以上,且金属离子Ca²⁺、Co     

嗜麦芽窄食单胞菌胞内具二硫键还原活性酶蛋白的研究

研究旨在克隆并表达嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞内具二硫键还原活性的酶蛋白。以Stenotrophomonas maltophilia基因组DNA为模板,扩增目的基因谷胱甘肽还原酶(Glr),构建重组质粒p ET-22b-Glr,并转化到表达菌株BL21(DE3)中得到重组菌,经IPTG诱导表达后,测定二硫键还原酶活性。结果表明,该重组酶基因大小为1 359 bp,酶活力为1.85 U/mg。酶学性质研究表明,重组谷胱甘肽还原酶的最适反应p H值为6.0,最适反应温度为40℃。对角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究表明,该酶对其降解羽毛促进率为15%。结果揭示了Stenotrophomonas malto-philia胞内液具有促进胞外液角蛋白水解活性的内在机制。     

植酸酶基因在嗜酸乳杆菌中的表达

植酸酶和嗜酸乳杆菌是重要的饲料添加剂,为获得产植酸酶的嗜酸乳杆菌菌株,克隆了大肠杆菌植酸酶基因,构建表达载体并转化嗜酸乳杆菌,对重组嗜酸乳杆菌进行发酵产酶并测定所产酶液的酶学性质,进一步研究重组嗜酸乳杆菌的耐酸性及植酸酶液的抗蛋白酶活性。结果表明：重组嗜酸乳杆菌发酵24 h植酸酶活性为984 U/mL,植酸酶的最适催化pH为4.5,最适催化温度为60℃。重组嗜酸乳杆菌在pH 2.0～4.5有一定的耐酸性,在pH 2.0条件下2 h的存活率为76.4%。植酸酶液用胃蛋白酶处理160 min后植酸酶液剩余85%的相对酶活,用胰蛋白酶处理160 min后剩余29%的相对酶活。上述研究结果为重组嗜酸乳杆菌后续应用研究提供了重要依据。     

米曲霉ZW-06中性蛋白酶白粗分离及酶学性质研究

从米曲霉(Aspergillus oryzae)ZW-06发酵干曲中对中性蛋白酶进行粗分离,并对其酶学性质进行研究.结果表明用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的酶活力高达264443 U/g;该酶的最适反应温度为45℃,最适作用pH为6.5和9.0;该酶在常温及pH 6～10的环境下比较稳定;Mg2+、Mn2+和Ca2+对蛋白酶有强烈的激活作用,Fe2+和Cu2+则对其表现出强烈的抑制作用.动力学研究表明,该中性蛋白酶在pH 6.5和45℃条件下,Km为3.82 mg/mL,Vmax为541 U/mg·min.     

柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析

利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。     

2个枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆、融合表达及其酶学性质分析

本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn~(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg~(2+)和Cu~(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。     

干法和湿法猪发酵床垫料中磷的变化规律研究

为完善猪发酵床养殖技术及促进土壤对垫料中磷的利用,研究分析同等时间干法发酵床和湿法发酵床表层垫料、中层垫料和底层垫料中磷的变化情况。结果表明：（1）湿法发酵床垫料水分含量、温度极显著高于干法发酵床（35.54%＆31.49%、34.87℃＆31.91℃）,垫料深度对水分含量、pH、温度有极显著影响（P〈0.01）,垫料中层温度最高;（2）湿法发酵床和干法发酵床总磷含量无差异（3.00%＆3.43%）;植酸磷极显著低于干法发酵床（21.04mg/kg＆27.59mg/kg）,有效磷极显著高于干法发酵床（94.22mg/kg＆91.16mg/kg）,垫料深度对总磷、植酸磷、有效磷有极显著影响（P〈0.01）;（3）湿法发酵床植酸酶、中性磷酸酶、脲酶活性高于干法发酵床（2.98U/L＆2.56U/L、25.83mg/g＆21.77mg/g、1.93U/L＆1.88U/L）,垫料深度对该三种酶活性有极显著影响（P〈0.01）;垫料中层总磷、植酸磷、有效磷含量及该三种酶活性最高。发酵床种类和垫料深度对垫料pH、植酸磷、植酸酶活性的互作极显著（P〈0.01）。研究表明,发酵床中磷的降解主要发生在垫料中层,湿法发酵床更有利于垫料中磷的降解,干法发酵床在养殖过程中需增加垫料的湿度。     

瘤胃微生物植酸酶的分类与酶学性质研究进展

反刍动物能很大程度上依靠瘤胃微生物来消化利用饲料中的植酸盐,但目前国内有关瘤胃微生物植酸酶的研究报道较少.本文对瘤胃微生物植酸酶的主要来源和活性进行了综述分析,发现主要有5种瘤胃细菌能分泌植酸酶,其中,反刍兽新月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)分泌的植酸酶活性最高(199.1～703.6 U·mL-1)；根据酶促反应的最适pH和催化机理,可将瘤胃微生物植酸酶分别归类为酸性植酸酶和半胱氨酸磷酸酶植酸酶；根据植酸酶水解植酸时的立体专一性,发现瘤胃微生物植酸酶中可能同时存在3-植酸酶和5-植酸酶2类植酸酶.最后本文论述了瘤胃微生物植酸酶酶促反应动力学特性,发现反刍兽新月形单胞菌植酸酶的最适pH为4.0～5.5、最适温度为50～55℃、对植酸和ATP表现出较强的活性；埃氏巨形球菌植酸酶的最适pH为5,0、最适温度为60℃、仅对植酸表现出活性.     

米曲霉ZW-06中性蛋白酶的粗分离及酶学性质研究

从米曲霉(Aspergillus oryzae)ZW-06发酵干曲中对中性蛋白酶进行粗分离,并对其酶学性质进行研究。结果表明:用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的酶活力高达264443U/g;该酶的最适反应温度为45℃,最适作用pH为6.5和9.0;该酶在常温及pH6～10的环境下比较稳定;Mg2+、Mn2+和Ca2+对蛋白酶有强烈的激活作用,Fe2+和Cu2+则对其表现出强烈的抑制作用。动力学研究表明,该中性蛋白酶在pH 6.5和45℃条件下,Km为3.82mg/mL,Vmax为541U/mg·min。     

副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶的原核表达与活性检测

克隆表达副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC),并测定其酶学特性。以副猪嗜血杆菌SH0165菌株基因组为模板,将BgaC基因的序列(1 791bp)克隆到pET32a质粒上,并电转化BL21表达菌株。以His标签融合蛋白纯化操作方法纯化表达产物。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定β-半乳糖苷酶的天然分子质量,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷为底物测定其酶学特性。结果表明,在大肠埃希菌BL21中成功表达了副猪嗜血杆菌的BgaC基因,经鉴定pET32a+BgaC重组菌表达的蛋白大小为82.4ku。纯化后BgaC的酶比活力为1 795U/mg,pET32a+BgaC重组蛋白的最适pH为6~7,最适温度为30℃~37℃。副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC)具有糖苷酶活性能够介导糖蛋白的降解,在氨基酸序列上存在高度保守的区域,在生物技术领域具有广泛的应用前景。     

日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

为解析日本血吸虫精氨酸酶的功能,本研究克隆了SjARG基因、长度为1095 bp,并将该基因克隆一到原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET-28a-SjARG,并在大肠杆菌中成功表达,Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性;通过酶活性分析显示,重组蛋白SjARG在添加Mn2+后活性得到提高,酶活性大小为502 U/mg,Km值为82.7mM。该研究结果为进一步深入研究该基因的表达特性、酶学性质以及候选疫苗分子研究方面提供了基础。     

鸡毒支原体磷酸酶PrpC活性检测

HPr激酶/磷酸酶(PrkC/PrpC)系统在细菌和支原体中高度保守,不仅参与糖酵解酶类的磷酸化/去磷酸化,也与毒力、生物被膜等生命活动相关。克隆并突变获得编码鸡毒支原体磷酸酶PrpC的ptc1基因,经原核表达纯化后,利用底物PNPP体外检测其酶活性,并对影响该酶活性的pH、金属离子、温度等影响因子进行分析。结果表明,Ptc1蛋白具有磷酸酶活性,Mn2+为该酶辅因子,最适离子浓度为2mol/L,最适pH为8.5,最适温度为37℃。相同浓度的Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Al 3+、Hg2+等金属离子均对表达产物具有不同程度的抑制活性。初步建立了PrpC功能检测体系,为进一步深入研究PrkC/PrpC调节系统奠定基础。     

黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析

本试验旨在从一株黑曲霉中克隆单宁酶基因,并研究其酶学性质。利用前期分离的一株黑曲霉菌株SL-5,克隆出单宁酶基因,基因全长1533 bp,编码510个氨基酸;使用大肠杆菌BL21作为宿主,并使用p ET32a(+)作为表达载体,实现了单宁酶基因在大肠杆菌中的表达。纯化的单宁酶能够降解单宁,酶的最适反应温度为40℃,最适反应p H为6.0。     

棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆及原核表达

从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。     

晋南黄牛IFN-α基因的克隆、表达及抗病毒活性研究

本研究通过PCR从晋南黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了IFN-α(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后直接与载体PQE30连接,构建重组质粒PQE30/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,晋南黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与所报道的BoIFN-α 8个亚型中D亚型最接近,氨基酸序列同源性为97.0%.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,表达出20kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的20%,表达产物以包涵体形式存在,包涵体占沉淀蛋白的35%.包涵体提取物用8 M尿素溶解变性,经尿素和PBS透析复性后初步纯化.重组牛IFN-α(rBoIFN-α)初提物在MDBK-VSV和CEF-VSV上的活性分别为2.3～6.5×106U/mg和1.3～4.1×105U/mg,对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)有一定的抑制作用,抗病毒效价达到8.2×105U/mg.结果显示大肠杆菌可以高效表达具有生物学活性的rBoIFN-α.     

1株耐酸秸秆纤维素降解菌株的筛选、鉴定及其内切葡聚糖酶的异源表达研究

试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中，秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源，从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性，利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定，通过分子克隆技术，构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示，菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL，最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ，异源表达后获得重组酶，分子量约为55 kDa，粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明，试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上，实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达，可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。     

瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因的表达与酶学特性研究

旨在表达来源于瘤胃厌氧真菌基因组的4个木聚糖酶基因A、C、D和F,并比较分析其酶学特性。首先根据大肠杆菌基因编码偏好,合成可在大肠杆菌中表达的木聚糖酶基因序列,然后采用同源重组的方法将各序列分别插入载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中异源表达,并研究其酶学特性,结果成功表达出来源于厌氧真菌的4个木聚糖酶基因。测定其酶学性质发现,4种木聚糖酶的反应最适pH值均为8.0;木聚糖酶D的反应最适温度为37℃,其余3种木聚糖酶的反应最适温度均为45℃;4种木聚糖酶具有广泛的温度稳定性和pH稳定性;金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺显著促进木聚糖酶活性(P<0.05),而Zn²⁺则有明显的抑制作用(P<0.05);4种木聚糖酶降解山毛榉木聚糖的能力显著高于其他底物(P<0.05)。本研究成功表达了4种来源于厌氧真菌的木聚糖酶,其良好的温度和pH稳定性具有潜在的工业应用价值。     

木质素降解菌的筛选及其漆酶性质研究

为筛选产漆酶的木质素降解菌,采用愈创木酚平板法和RB亮蓝平板法进行菌株筛选,利用16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,通过液体发酵培养对漆酶活性和木质素降解能力进行研究。将漆酶基因cot A克隆到表达载体p ET-32a(+)上获得重组质粒p ET-32a(+)-Cot A并转化到BL21中进行表达,通过酶活测定将表达条件进行优化。结果:从白蚁肠道中成功筛选出1株产漆酶的木质素降解菌,鉴定为枯草芽胞杆菌。漆酶的最适酶活温度为60℃,最适酶活p H为3.5~4.0;0.2 mmol/L Cu2+可诱导菌株漆酶的产生,缩短了产酶时间并提高了酶活性。菌株木质素降解率在液体发酵培养24 h后达到了17.1%。漆酶基因大小为1 542 bp,表达的重组蛋白为85 ku,属于有活性的可溶性蛋白。在IPTG浓度为1mmol/L、Cu2+浓度为0.3mmol/L、诱导时间为9 h的条件下,漆酶蛋白活性可达到113.10 U/L。研究表明,本试验成功筛选出1株降解木质素能力较强的枯草芽胞杆菌,获得可分泌较高活性漆酶的重组菌,为木质素酶在畜牧业生产实践上的应用奠定了基础。     

产纤维素酶枯草芽孢杆菌Kpg酶学性质研究及对麸皮纤维素含量的影响

对枯草芽孢杆菌B.subtilis Kpg所产纤维素酶的酶学性质进行研究,确定该纤维素酶的最佳温度和最适pH,并进行固体发酵麸皮试验,验证Kpg纤维素酶的实践效果。试验以3,5-二硝基水杨酸酶活测定法为基础,通过改变纤维素酶的反应温度和pH环境,确定最适反应温度和最适pH环境。为研究其实际降解能力,将枯草芽孢杆菌Kpg添加到麸皮中,在37℃环境中发酵6d。结果显示,枯草芽孢杆菌Kpg纤维素酶的最适反应温度为60℃,此时纤维素酶活性最大为108.45U/mL;反应液最适pH值为6.0,此时纤维素酶活性为97.72U/mL;在两者最适条件共同作用下,纤维素酶活性为113.58U/mL。发酵试验结果显示,枯草芽孢杆菌Kpg能够显著降低麸皮中的纤维素含量(P0.05),同时显著提高发酵麸皮中的真蛋白含量(P0.05)。枯草芽孢杆菌Kpg表现出的酶学性质符合发酵微生物选育的标准和特征,为生物饲料的开发和应用提供数据参考。