中国水牛三种住肉孢子虫包囊的比较电镜研究

对采自中国湖南水牛食道肌内大小不同的包囊进行了比较研究和描述。透射电镜观察的结果显示:大包囊(9.3mm×3.4mm)的超微结构与已报道的水牛梭形住肉孢子虫S. arcocystis justprmis一致,包囊壁表面形成带有分支的菜椰花样的突起,突起内含纤丝和基质,基质层向腔内形成隔,细胞排列疏松;小包囊的一种(2.4mm×0.2mm)与已报道的水牛利文往肉孢子虫S.levtnei的一致,包囊壁表现形成倾斜的长绒毛样的突起,突起内含纤丝,致密颗粒和基质,有隔,细胞排列不甚紧密,而另一种小包囊(0.94mm×0.17mm)则与黄牛的枯氏住肉孢子虫cruzi的一致,包囊壁表面形成倒伏的指状突起,突起内不含纤丝和致密颗粒,有隔,细胞排列紧密。这一观察表明,我国水牛存在三种住肉孢于虫,即梭形住肉孢子虫、利文住肉孢子虫和枯氏住肉孢子虫。     

黄牛住肉孢子虫超微结构研究

依据电镜下包囊的超微结构从黄牛肌肉中鉴别出３种住肉孢子虫：枯氏住内孢子虫、毛形住肉孢子虫和人住肉孢子虫。估氏住内孢子虫超微结构的特点是,原囊壁向表面突出形成倒伏的指形突起,突起内无纤丝、微管和致密颗粒。毛形住内孢子虫与人住内孢子虫的年轻包囊很难区别,其包囊突起均为栅栏样构造,突起内有纤丝,而老包囊在毛形住肉孢子虫与人住内孢子虫之间有明显区别,前者突起的壁平滑,突起内有纤丝,而后者突起壁呈波浪形,突起内有微管和致密颗粒。     

核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫的研究

为了将家蚕微孢子虫（N.b.）从蚕业生产中流行的10多种病原性微孢子虫中鉴定出来，并对其发病程度进行检测，用PCR技术合成了一段317bp的DNA片段，将其克隆到大肠杆菌E.coli DH5α中，并大量制备该片段，用地高辛（DIG）标记成探针，经点杂交和Southern杂交检测，发现该片段为N.b.所特有。该探针为N.b的特异性检测探针，灵敏度可达1ng DNA水平。对蚕业生产上的带毒蚕蛾和蚕卵的模拟检测证明，该DIG探针可将N.b发病初期的带毒蚕蛾和蚕卵检出，从而可以避免微粒子病的大发生。     

绵羊住肉孢子虫的超微结构

利用电镜下包囊的超微结构从绵羊鉴别出3种住肉孢子虫,它们是巨型住肉孢子虫、绵羊犬住肉孢子虫、羯犬住肉孢子虫。巨型住肉孢子虫的包囊壁由次生壁和原囊壁组成,原囊壁形成的突起呈花椰菜样,突起内含有管状纤丝和致密颗粒。绵羊犬住肉孢子虫的原囊壁向表面形成栅栏样的突起,突起内无纤丝和致密颗粒。羯犬住肉孢子的原囊壁向表面皱褶形成条带状突起,突起内无纤丝,含少量致密颗粒。在绵羊体内还发现一待定种,其原囊壁向表面形成指形突起,突起内不含纤丝和致密颗粒。     

交叉感染后黄牛与水牛枯氏住肉孢子虫包囊超微结构的比较研究

试验选用4头7日龄奶牛和4头4～5月龄水牛,用水牛源孢子囊感染黄牛及黄牛源孢子囊感染水牛,同时设感染对照和不感染对照,对交叉感染后黄牛与水牛体内包囊的超策结构进行了比较研究,观察结果发现两种来源的包囊无结构区别,所有包囊的超微结构与前人对黄牛与水牛枯氏住肉孢子虫Sarcocystis cruzi的描述一致,进一步地证实水牛是枯氏住肉孢子虫的新中间宿主。此外,作者首次在枯氏住内孢子虫包囊内的母细胞和缓殖于发现晶状体。     

梭形住肉孢子虫和巨型住肉孢子虫包囊各部分的免疫特性研究

运用对流免疫电泳(CIE)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对梭形住肉孢子虫和巨型住肉孢子虫的包囊壁、包囊液、缓殖子及全色囊抗原的免疫特性进行了比较研究。结果表明:缓殖子抗原对抗血清的免疫反应最强.     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

检测牛感染犬新孢子虫的TaqMan-MGB Real-time PCR方法的建立

为建立牛感染犬新孢子虫的Real-time PCR检测方法,根据犬新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立新孢子虫病TaqMan-MGB Real-time PCR检测方法。PCR扩增产物约为150bp,与预期片段大小相符;Real-time PCR扩增表明,Ct值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系;当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性DNA时均为阴性;经3D数字PCR判定,Real-time PCR方法的最低有效检测量为6.41拷贝/μL,灵敏性是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内平均变异系数为1.108%,组间为2.732%;本方法与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为100%(46/46)。该Real-time PCR方法可用于早期诊断和日常监测家畜感染犬新孢子虫。     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

3种牡蛎原虫的流行情况调查及多重PCR检测方法

应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测到10 pg牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫DNA,表明该方法适用于这3种原虫的快速检测和鉴别诊断.     

德宏水牛和摩拉水牛及杂交后代的遗传差异分析*

 为了解德宏水牛、摩拉水牛及二者杂交后代之间的遗传差异,本研究采用随机扩增多态性DNA标记技术,从70个随机引物中筛选出11个多态性丰富的引物对德宏水牛、摩拉水牛及二者杂交后代共80个个体进行了遗传变异检测,结果11条引物共产生89种扩增片段,多态片段73条,多态率82.02%。两亲本群体相对遗传距离为 0.220 3 ,杂交后代群体与德宏水牛、摩拉水牛群体的相对遗传距离分别为 0.101 7 和 0.135 3 ,表明杂交后代群体与两亲本群体间的遗传差异小于两亲本群体间的遗传差异,杂交后代群体与德宏水牛群体遗传关系更接近。     

Screening of a Composite Microbial System and Its Characteristics of Wheal Straw Deqradation

To accelerate the decomposition of wheat straw directly returned to soil,we constructed a microbial system (ADS-3) from agricultural soil containing rotting straw residues using a 40-wk limited cultivation.To assess its potential use for accelerating straw decomposing,the decomposing characteristics and the microbial composition of ADS-3 were analyzed.The results indicated that it could degrade wheat straw and filter paper by 63.8 and 80％,respectively,during 15 d of incubation.Straw hemicellulose degraded dramatically 51.2％ during the first 3 d,decreasing up to 73.7％ by the end of incubation.Cellulose showed sustained degradation reaching 53.3％ in 15 d.Peak values of xylanase and cellulase activities appeared at 3 and 11 d,with 1.32 and 0.15 U mL-1,respectively.Estimated pH averaged 6.4-7.6 during the degradation process,which approximated acidity and alkalinity of normal soils.The microbial composition of ADS-3 was stable based on denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis.By using bacterial 16S rRNA and fungal 26S rRNA gene clone library analysis,20 bacterial clones and 7 fungal clones were detected.Closest identified relatives of bacteria represented by Bacillus fusiformis,Cytophaga sp.,uncultured Clostridiales bacterium,Ruminobacillus xylanolyticum,Clostridium hydroxybenzoicum,and uncultured proteobacterium and the fungi were mainly identified as related to Pichia sp.and uncultured fungus.     

多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K＋二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20＋DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20＋DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20＋DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20＋DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

槟榔江水牛群体遗传结构的RAPD分析

 为探讨RAPD标记在水牛遗传多样性方面检测的应用价值，以及了解槟榔江水牛的群体遗传结构状况，研究采用随机扩增多态性DNA标记技术对槟榔江水牛20个个体进行了遗传变异分析，从70个随机引物中筛选出15个多态性丰富的引物对其所有个体的总基因组DNA进行了PCR扩增，结果15条引物共产生105种扩增片段，多态片段95条，平均每条引物的扩增带数为7，各引物多态性片段范围在2～12之间，多态频率在40%～100%之间，多态座位平均为90.48%。表明槟榔江水牛的遗传多样性较丰富。     

福安水牛线粒体DNA Dloop区遗传多样性分析*

 采用PCR产物直接测序的方法对20头福安水牛的线粒体DNA（mtDNA）D LOOP区全序列进行了测定,并对所得数据进行了比对和分析。结果共检测到16种单倍型,48个核苷酸多态位点,其中单一变异位点9个,简约信息位点39个。在所分析的序列中,T,C,A和G的平均含量分别为27.9%,25.6%,31.9%和14.6%,核苷酸多样度为0.01946±0.00288,单倍型多样度为0.957±0.032,序列间平均核苷酸差异数是17.238,结果显示福安水牛线粒体DNA遗传多样性丰富。系统发育和遗传距离分析显示：福安水牛与河流型水牛存在较大差异,其自身聚为支持率极高的两大支,即世系A和世系B,揭示福安水牛存在两个母系血统来源。     

羊栖菜硫酸多糖的抗凝血活性研究

[目的]探讨羊栖菜硫酸多糖的抗凝血活性。[方法]从水提液中提取羊栖菜硫酸多糖,通过体内和体外的抗凝血试验系统地研究其抗凝血活性。[结果]利用葡聚糖凝胶G-75分离纯化所提取的羊栖菜硫酸多糖F1,得到5个不同组分。在2.0 g/L的受试条件下,组分F12抗凝血活性的最强,其延长小白鼠的出血时间和凝血时间、大白兔的凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间分别为粗多糖F0的174.2%、153.7%、311.9%1、57.8%和218.2%。羊栖菜硫酸多糖F1与抗凝血效果有显著的量效关系。在受试条件下(浓度为0.5~2.0g/L),多糖的浓度与小白鼠的抗凝血指标、与大白兔体外抗凝血指标之间均呈现良好的直线回归关系。[结论]该研究为羊栖菜类保健品及临床药物的开发提供理论基础。     

水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究

[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20 h(P0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。