鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

科技

正大连三仪重组鸡白细胞介素-2注射液被农业部批准为国家一类新兽药1月11日,农业部发布新年首个国家一类新药公告,大连三仪申报的具有独立自主知识产权的重组鸡白细胞介素-2注射液,被农业部批准为国家一类新兽药,获得农业部颁发的国家一类新兽药证书,成为我国1949年建国以来国内唯一一个获此级别注册证书的重组细胞因子类新药。从此,中国兽药典里又多了一个品类,动物用重组细胞因子。     

基因重组鸡α-干扰素在肉鸡体内的药代动力学研究

选择40只32日龄健康AA肉鸡按1万IU/0.6ml基因重组鸡α-干扰素0.6ml肌肉注射给药后,不同时间点采血。用基因重组鸡α-干扰素检测试剂盒检测血清中浓度,研究其在血清中的药代动力学。通过3P97药动学软件分析主要药物动力学参数:分布半衰期(T_(1/2α))、消除半衰期(T_(1/2β))、药物清除率(CL)、药时曲线下面积(AUC)等。结果表明,肌肉注射1万单位基因重组鸡α-干扰素后肉鸡吸收迅速,达峰时间短,吸收较完全,能在体内较快的消除。     

表达鸡α干扰素重组酿酒酵母菌的构建与鉴定

通过构建鸡α干扰素真核表达载体,以获得能够表达鸡α干扰素的酵母工程菌株。首先根据GenBank公布的鸡α干扰素基因序列设计上、下游引物,以略阳乌鸡基因组DNA为模板,PCR扩增鸡α干扰素基因片段。然后,利用基因重组技术将鸡α-干扰素基因插入真核表达载体,通过菌落PCR和DNA测序确定目标载体,构建成功后转化至酿酒酵母AH109,再通过营养缺陷培养、质粒提取和PCR鉴定带JMB440-ChIFN-α载体的重组酵母菌株。最终通过酵母培养、总蛋白收集、SDS-PAGE电泳和Western blot等,确定鸡α干扰素基因能够与酵母菌株重组,并表达α干扰素,蛋白条带大小约为23ku,与预期结果一致,表明成功构建了表达鸡干扰素基因的工程酵母菌株。     

农业部放行美转基因大豆

农业部不久前宣布,自4月21日起,我国进口农业转基因生物将实施正常管理,为期两年的临时管理措施终止。据悉,世界上最大的转基因农产品企业美国孟山都公司的转基因大豆等5个产品,最先获得中国政府颁发的进口安全证书,其他公司目前正在进行安全性评价的申请产品,也有望于近期获得安全证书。但农业部并未对孟山都转基因大豆发放永久性的转基因产品安全证书。农业部官员说:“农业部颁发的转基因生物安全证书具有有效期,转基因大豆和玉米是3年,转基因棉花是5年,不存在永久性证书的问题。”中国终止两年来的临时过渡性管理措施,将转基因产品纳入正…     

中华人民共和国农业部公告第190号

根据国务院2001年5月23日发布的《农业转基因生物安全管理条例》的规定,农业部于2002年1月5日发布了《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》,并将于2002年3月20日正式实施。 从本公告发布之日起,境外公司向农业部农业转基因生物安全管理办公室提出农业转基因生物进口安全证书的申请,农业部按有关规定做出批准或不批准的决定。为使自申请到批复的270天内转基因农产品贸易正常进行,农业部采取如下临时措施:向中国出口转基因生物的境外     

我国自行研制的高致病性禽流感疫苗即将上市

由国内科研人员研制的高致病性禽流感疫苗即将获得新兽药证书在国内上市。据科技部介绍,H5N1基因工程灭活疫苗、H5N1鸡痘病毒活载体基因工程疫苗已通过农业部新兽医药评审委员会的复审,即将获得新兽药证书;H5亚型禽流感亚单位疫苗已获得农业转基因生物安全证书。H5N1基因工程灭     

农业部发布《转基因安全管理临时措施公告》

２００２年３月１１日，农业部发布《转基因安全管理临时措施公告》（第１９０号），规定临时措施有效期截止到２００２年１２月２０日。鉴于技术的原因，农业部决定延长转基因农产品安全管理临时措施实施期限，并公告如下：从本公告发布之日起，向中国出口转基因农产品的境外公司，可在研发公司已申请该转基因生物安全证书，并按农业部规定在中国境内进行安全评价检测试验的基础上，持产地国国家安全评价机构出具的有效文件，向农业部农业转基因生物安全管理办公室申请临时证明。对审查合格者，农业部将在３０个工作日内发给一次性有效的临…     

创新驱动未来——国家一类新兽药重组鸡白细胞介素-2发布暨三仪集团VIP客户答谢会在扬州隆重召开

正重组鸡白细胞介素-2,被农业部批准为国家一类新兽药,获得农业部颁发的国家一类新兽药证书,成为我国建国以来国内唯一一个获此级别注册证书的重组细胞因子类新药。三仪重新改写了中国兽药典收录的新药家族谱系,留下了历史性浓墨重彩的一笔。2018年3月18日,国家一类新兽药重组鸡白细胞介素-2发布暨三仪集团VIP客户答谢会在美丽的古城扬州隆重召开。中国畜牧兽医学会副理事长乔玉锋,扬州大学党委书记姚冠新,中国工程院院     

鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293T细胞中的表达

为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

鸡β干扰素的原核表达及抗病毒活性检测

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化后,SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表达正确,并且表达量较高。重组鸡β干扰素蛋白在DF-1细胞上能明显抑制水疱性口炎病毒繁殖,抗病毒活性达2.73×10~6UI/mg。本研究结果为鸡β干扰素在临床防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

重组鸡α-干扰素对鸡新城疫感染的治疗及疫苗免疫的影响

对试验鸡进行新城疫人工感染的干扰素治疗试验,试验SPF鸡分成5组,1～3组分别于攻毒前24h、攻毒的同时和攻毒后24h注射重组鸡α-干扰素,4、5组作为病毒对照和空白对照。同时,还进行了重组鸡α-干扰素对新城疫弱毒苗和灭活苗免疫效果的影响试验,结果显示,试验2、3组的平均死亡时间明显延长,免疫试验免疫后14d注射重组鸡α-干扰素可以降低新城疫抗体的滴度。     

国内自行研制的禽流感疫苗获准上市

我国科技人员研制的高致病性禽流感疫苗即将获得新兽药证书在国内上市。据科技部介绍，H5N1。基因工程灭活疫苗、H5N1鸡痘病毒活载体工程疫苗己通过农业部新兽药评审委员会的复审，即将获得新兽药证书；H5亚型禽流感亚单位疫苗己获得农业转基因生物安全证书。     

略阳乌鸡ɑ干扰素原核表达载体构建及诱导条件优化

为了探索略阳乌鸡α干扰素在大肠杆菌中高效表达的诱导条件,试验采用PCR获得略阳乌鸡α干扰素成熟肽段的编码区DNA序列,将其克隆至载体p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位点间,并通过菌落PCR和测序鉴定获得的鸡α干扰素的原核表达载体p ET-32a-Ch IFN-α。将p ET-32a-Ch IFN-α转化至大肠杆菌Rosetta菌株,通过筛选获得阳性克隆,进而分别对诱导表达时间、诱导剂浓度等条件进行筛选,获得了略阳乌鸡α干扰素的最佳表达条件。结果表明:成功构建p ET32aCh IFN-α质粒和重组菌株,最适诱导表达条件为诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间5 h,诱导时机OD600值为0.448时。说明构建略阳乌鸡α干扰素的原核表达菌株成功,并且实现了α干扰素的高效表达。     

重组鸡α-干扰素对新城疫病毒复制的影响

毕赤酵母表达鸡α-干扰素经纯化后,以50000U、5000U和500U分别与200ELD50新城疫病毒疫苗株LaSota和中等毒力Q株等量混合,接种9～10日龄SPF鸡胚,记录鸡胚死亡情况并测定尿囊液HA效价,结果表明,高浓度重组干扰素可使病毒致死鸡胚时间延长,并使Q株在尿囊液中的HA效价下降2～3个滴度。     

我国科学家研究高致病性禽流感防治获重大突破

中国农科院哈尔滨兽医研究所日前传来消息，设在该所的国家禽流感参考实验室承担的科技部重大专项——“高致病性禽流感防治技术研究与开发”项目近日取得重大突破。该项目中所包含的“H5N1亚型禽流感灭活疫苗的研制与应用开发”、“H5亚型禽流感重组鸡痘病毒基因工程疫苗产业化及其关键技术的研究”、“H5N2亚型禽流感灭活疫苗的新型工艺技术研究”、“高致病性禽流感病毒亚型鉴定技术的研究”等4个课题，日前全部通过了科技部的验收。其中，“H5N1亚型重组禽流感病毒灭活疫苗”和“H5亚型禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗”达到国际先进水平，获得了农业部颁发的农业转基因生物安全证书和新兽药注册证书。     

牛α干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性.     

科技

<正>家蚕生物反应器家族再添新成员近日,农业农村部向中国农业科学院生物技术研究所颁发了重组杆状病毒rBmNPV表达的鸡γ-干扰素和猫ω-干扰素两项生产应用安全证书,标志着利用家蚕生物反应器生产动物用基因工程制品范围得到进一步拓宽。生物所微生物蛋白质工程创新团队通过多年研究,成功实现了鸡γ-干扰素在家蚕生物反应器中的重组表达。该产品具有生物活性好、生产成本低(每粒蚕蛹可产千万IU的干扰素、每只鸡全龄应用的直接成本约1分钱)、可