表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测

慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体的构建及其在鸡肝癌细胞系中的表达

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×10⁵ TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。     

禽白血病病毒衣壳蛋白P27慢病毒载体的构建及其在鸡肝癌细胞中的表达

为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×10⁴TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。     

H9N2亚型禽流感病毒HA-M2融合基因的真核表达及免疫原性研究

选择H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的两个保守T细胞表位基因和M2基因胞外保守序列(M2e),经人工合成并通过PCR扩增获得HA-M2融合表位基因,与载体p Fast Bac HTA连接,构建重组真核表达质粒p Fast HTA-HA-M2。阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,转染Sf9昆虫细胞获得含HA-M2基因的重组杆状病毒,重组杆状病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot鉴定。利用目的蛋白免疫3周龄SPF鸡,采用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖。结果显示,目的蛋白HA-M2在昆虫细胞中有特异性表达,能被H9亚型AIV免疫阳性血清所识别,可诱导高滴度的AIV特异性抗体。试验结果为新型禽流感通用疫苗的研制奠定了基础。     

质粒载体表达抑制猪瘟病毒shRNA在猪胚胎成纤维细胞上的复制

以质粒pSilencer3.1Hygro为基础,构建了针对猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因mRNA的siRNA双表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞后,在潮霉素B的筛选压力下,获得5株稳定整合shRNA表达盒的猪胚胎成纤维细胞克隆.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72 h后对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的5株细胞克隆中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖明显降低,表明所构建siRNA双表达载体转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.本试验为研究猪瘟病毒的防治和通过RNAi建立猪的抗病育种提供了新的方法.     

波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋...     

表达猪H1N1亚型流感病毒三聚体HA的重组慢病毒包装

以RT—PCR扩增猪H1N1流感病毒HA基因,用GS-linker使HA与GCN4pⅡ连接。构建慢病毒蛋白表达系统。通过观察荧光、病毒转导效率、SDS—PAGE、Western blot验证重组慢病毒包装和HA—GCN4pⅡ融合蛋白表达情况。该系统能使外源基因得到持久和稳定的表达。结果,包装获得能够融合表达HA-GCN4pⅡ的重组慢病毒LV—HA-GCN4pⅡ,病毒滴度为1．1×10^6TU／mL;LV—HA—GCN4pⅡ能有效转导293T细胞。本试验成功构建了表达HA—GCN4PⅡ融合蛋白的慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒不仅为后续动物试验测定其诱导的体液免疫和细胞免疫水平奠定了基础,同时也为研制猪H1N1亚型流感疫苗做出了有益尝试。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。     

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

金丝桃素蛋白络合物体外抗H5N1亚型禽流感病毒的活性研究

用鸡胚法进行了金照桃素蛋白络合物抗HSNI亚型禽流感病毒活性研究。分别采用了感染病素同时给药、给药后接种病毒、先感染病毒后给药三种方式，通过测定鸡胚尿囊液的血凝效价和计算药物对感染鸡胚的保护率，观察金丝桃素蛋白络合物的抗H5N1亚型禽流感病毒活性。实验结果表明，①药物在体外与病毒作用一段时间后不规则将其混悬液接种鸡胚，药物浓度在0.5mg/ml以上时，对感染鸡胚的保护率达100%。同时给药组的血凝效价显著降低，与对照组相比差异极显著；②在感染病毒前给药，药物浓度在2mg/ml以上时，对感染鸡胚的保护率达100%，药物组的血凝效价显著降低，与对照组相比差异极显著；③先感染病毒后给药，药物浓度在2mg/ml以上时，对感染鸡胚的保护率达88.9%，血凝效价明显隆低，与对照组相比差异显著。同时，在此种方式下，药物对病毒的抑制作用与药物浓度有一定依赖性，适当提高药物浓度，可以增强其抗病毒活性。     

Baculovirus-mediated gene expression in chicken primary cells

A recombinant baculovirus was constructed containing an expression cassette with a reporter gene, green fluorescent protein, directed by a constitutive mammalian promoter: a human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer (CMV-IE). High titer virus was prepared with ultracentrifugation. Efficient gene delivery and expression were observed in the virus-treated chicken primary culture, myoblast cells, and whole embryonic fibroblast cells. It was noticed that an addition of sodium butyrate (a selective histone deacetylase inhibitor) to viral transduction medium extremely enhanced the reporter-gene expression. However, there is no effect of presence of trichostatin A observed. To maximize the reporter-gene expression, the baculoviral infection condition was optimized with both cell types. Our approaches demonstrated that recombinant baculovirus could efficiently deliver its genome DNA into chicken primary cells and that CMV-IE, a mammalian-cell-active promoter, was functional in chicken primary cells and could direct a high level of gene expression. Clearly, the recombinant baculovirus provides an alternative means for foreign gene delivery into avian cells.     

A comparison of avian and mammalian cell cultures for the propagation of avian reovirus WVU 2937

Two avian and seven mammalian cell lines were evaluated for their application in propagating avian reovirus WVU 2937. Cultures were compared for monolayer-formation time, support of viral replication, passages and postinfection time required for expression of cytopathic effect (CPE), type of CPE, and virus yield. CPE was observed on the first passage with infected egg yolk in primary chicken embryo kidney cells, primary through tertiary chicken embryo liver (CEL) cells, and African green monkey kidney (VERO) cells; on the third blind passage of infected supernatant in Georgia bovine kidney cells, Crandall feline kidney cells, and baby hamster cells; on the fifth blind passage in rabbit kidney cells; and on the tenth blind passage in porcine kidney cells. CPE was not observed after 10 viral passages in rabbit bone-marrow cells. Monolayer formation time and postinfection time for CPE expression occurred sooner, and virus yield was greater, with CEL and VERO cells than with other cell lines.     

含鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组火鸡疱疹病毒的构建

采用PCR方法，以传染性贫血病毒(CIAV)DNA为模板，扩增并克隆了CIAV的VP1、VP2基因，并进行了序列分析。经基因修饰，将这两个基因分别加上表达元件后连接作为目的基因。通过同源重组技术，将目的基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)gC基因区，构建了一株含CIAV VP1、VP2基因表达单元的重组HVT(VP1VP2-rHVT)：体内、体外传代结果表明该重组病毒性状稳定。采用PCR扩增及Southem blot杂交检测，证实了CIAV VP1、VP2基因的插入。     

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】 试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】 利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型（Avian metaavulavirus-2,AMAV-2） Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】 试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV NP ELISA抗体检测方法可以实现区分疫苗免疫与野毒感染。【结论】 本试验研发了一种基因Ⅶ型NDV嵌合候选疫苗,为基因Ⅶ型NDV的监测、防控和净化提供了技术支撑。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。