ILTV gB基因与鸡IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

本试验构建了能分别或同时表达ILTV gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB、pIRES-IL18、pIRES-gB/IL18。将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,35日龄加强免疫1次,二免后2周用ILTV HN1株进行攻毒。pIRES-gB/IL18和pIRES-gB+pIRES-IL18免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强ILTV DNA疫苗对强毒的攻击保护,但pIRES-gB/IL18免疫组要优于pIRES-gB+pIRES-IL18混合免疫组及其他对照组,差异显著或极显著。结果表明,鸡IL-18能明显增强ILTV DNA疫苗的免疫原性。     

PCV2ORF2基因与猪IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

为研制新型的PCV2基因疫苗,本研究将PCV2ORF2和猪IL-18基因插入真核表达质粒pIRES中,构建共表达capsid (Cap)蛋白和猪IL-18的质粒pIRES-OFR2/IL18和表达Cap蛋白的质粒pIRES-OFR2.将质粒pIRES-OFR2/IL18和pIRES-OFR2通过腿部肌肉多点注射8周龄昆明小鼠,间隔3周再免疫1次.加强免疫3周后用PCV2 Wuzhi株进行攻毒.pIRES-OFR2/IL18免疫昆明小鼠后能促进外周血T淋巴细胞增殖和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强PCV2 DNA疫苗对强毒的攻击保护,pIRES-ORF2/IL18免疫组要优于pIRES-ORF2免疫组及其它对照组,差异显著.表明猪IL-18基因与PCV2ORF2共表达可增强猪体对DNA疫苗的免疫应答,提高对PCV2强毒的抵抗力.     

鸡β-防御素-1对鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用

本文旨在研究鸡β-防御素-1(AvBD1)对鸡IBDVVP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用。通过基因工程技术,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2。14日龄岭南黄肉鸡随机分成5组,分别免疫PBS、空质粒载体pcDNA3.1(+)、重组质粒pcDNA3.1(+)-VP2、重组质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcD-NA3.1(+)-VP2联合免疫、IBD弱毒苗。收集免疫后不同时期的外周血血清样本,用ELISA方法检测血清中IB-DV VP2特异性抗体水平,通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量。结果表明,联合免疫组(即pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2共同免疫)VP2特异性抗体水平显著高于其他组;单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组VP2特异性抗体水平与免疫IBD弱毒苗组相当,显著高于PBS组与空质粒载体pcD-NA3.1(+)组。在二免后第7天,联合免疫组外周血中CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量也显著高于单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组,其它时间无显著性差异。IBDV攻毒...     

传染性支气管炎病毒结构蛋白免疫鸡对CD4+CD8+T淋巴细胞亚群的影响

为了比较传染性支气管炎病毒3种主要结构蛋白免疫鸡后对CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的不同影响.本试验以pVAX1载体为携带工具,制备分别含有IBV主要结构蛋白基因的质粒免疫健康雏鸡,采用流式细胞仪(FACS)对免疫鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测.结果显示:各试验组间,携带N蛋白基因的质粒在免疫后3周内CD4+T淋巴细胞数和CD8+T淋巴细胞数均高于其他组,且差异极显著(P＜0.01).由此可见,IBV的N蛋白可明显诱导CD8+T淋巴细胞的CTL免疫作用和CD4+T淋巴细胞的辅助性免疫作用,其细胞免疫原性高于S1蛋白和M蛋白.     

携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究

为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。     

禽传染性支气管炎脂质体、壳聚糖/DNA疫苗免疫效果比较研究

将制备的禽传染性支气管炎脂质体／DNA疫苗和壳聚糖／DNA疫苗，分别以肌肉注射（i．m）和滴鼻、点眼（i．n）两种途径免疫健康雏鸡，以裸DNA疫苗为对照，采用流式细胞仪（FACS）及间接ELISA分别对免疫鸡外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数及特异性IBV血清抗体IgG的动态变化进行检测，并于免疫后35d进行攻毒，结果显示：（1）CD4^＋T淋巴细胞数，所有试验组在免疫后1～3周左右均高于对照组（P〈0．01或P〈0．05），各试验组间，脂质体／DNA疫苗肌肉注射途径在免疫后10d后高于壳聚糖／DNA疫苗，但仅在第15天差异显著（P〈0．05），而滴鼻、点眼途径则相反；（2）所有试验组CD8^＋T淋巴细胞数仅在免疫后第15天与对照组差异显著（P〈0．05），各试验组间无显著差异；（3）所有组间特异性IBV血清抗体IgG动态变化差异不显著；攻毒后脂质体／DNA疫苗肌肉注射组无鸡只死亡，其他试验组有4％或8％死亡率，均显著低于对照组（12％）。由此可见，脂质体和壳聚糖均为DNA疫苗良好的佐剂或载体，且脂质体／DNA疫苗肌肉注射的免疫效果优于壳聚糖／DNA疫苗。     

猪IL2基因重组对PPV VP2-PCV2ORF2真核质粒免疫原性增强的研究

将猪IL2成熟肽基因、PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原多肤基因定向克隆至真核表达载体pCI-neo,构建重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2-ORV2-VP2,用脂质体介导法将其转染PK15细胞,采用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测重组质粒在体外的表达情况.并以小鼠为动物模型,分别将pCI-IL2-ORF2-VP2质粒、pCI-ORF2-VP2质粒、pCI空载体、猪细小灭活苗和圆环亚单位苗通过肌注进行免疫,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体效价.结果表明,重组质粒在体外能正常表达,pCI-IL2-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值在二免后均高于或显著高于pCi-ORF2-VP2对照组.结果表明,猪IL2基因重组能显著增强VP2/ORF2核酸疫苗诱导的免疫应答.     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用，分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3／cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡，首免后每周采取外周血及外周抗凝血，应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性，显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平，并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强，能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明，鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫增强效应研究

为研究鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗免疫效果的影响,根据GenBank登录的鸡IL-1β和IL-16序列设计两对引物,采用RT-PCR方法从四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆IL-1β和IL-16基因,与真核表达质粒pcDNA3.1(+)连接构建了pDNAIL-1β和pDNAIL-16。分别将两种重组质粒与IBVDNA联合免疫SPF雏鸡并进行攻毒试验。结果表明,pDNAIL-1β和pDNAIL-16均能促进血清中特异性抗体水平和外周血T淋巴细胞亚群数量的增加(p<0.05),增强IBV DNA疫苗对同型强毒的保护率15%～25%,pDNAIL-1β提升DNA疫苗的抗体水平的时间比pDNAIL-16多7d。试验表明,鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫具有增强作用。     

猪传染性胃肠炎病毒S、N基因核酸疫苗的构建与免疫原性试验

采用RT-PCR扩增TGEV SC-H株S基因5′端主要抗原位点编码区和全长N基因,将其插入真核表达载体pVAX1,构建单独与嵌合表达S、N基因的pVAX-S、pVAX-N、pVAX-S-N 3种重组质粒。通过脂质体将重组质粒体外转染COS-7细胞,利用间接免疫荧光检测目的基因的表达情况。将6周龄NIH小鼠随机分为5组,分别于腿部肌肉注射重组质粒pVAX、pVAX-S、pVAX-S-N、pVAX-S+pVAX-N与pVAX-S+pVAX,共免疫3次,间隔2周。通过间接ELISA以及流式细胞仪分别检测免疫小鼠血清中特异性TGEV IgG抗体和外周血T淋巴细胞亚群数量。结果显示,重组质粒构建正确且在COS-7细胞中得以表达;pVAX-S+pVAX-N质粒混合免疫组与pVAX-S+pVAX质粒混合免疫对照组相比,可有效提高免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,而pVAX-S-N免疫组与pVAX-S组比较,未能起到提高免疫小鼠血清中特异性抗体水平的和外周血T淋巴细胞亚群数量作用。以上结果表明S、N基因的联合应用可有效加强TGEV核酸疫苗的免疫效力,但这种增强作用与S、N基因联合应用的方式直接相...     

鸡传染性支气管炎野毒感染的诊断

疾病的诊断可以通过对鸡群病史、临床症状、血清学及病原分离与鉴定相结合的评价来完成。血清学监测在确定野毒感染的时间和性质上很有帮助。     

IBV野毒感染的诊断

疾病的诊断可通过综合评价鸡群的病史、临床症状、血清学特征及病原分离和鉴定来完成。血清学监测在一定程度上有助于鉴别出野毒感染的时间和特性。。     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒（QX IBV）的分离和鉴定

１９９６年９月份以来,青岛地区鸡群发生一种新病,通过鸡胚育５代－６代,电镜观察,动物回归和免疫保护试验,用气管环组织培养进行理化特性测定,毒价测定,中和试验,证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒,因为引起腺胃的特征性的病理变化,将此病暂定名为腺胃型传染性支管炎,将青岛分离株定主要特定的ＯＸ株。     

DNA免疫防制鸡传染性支气管炎的探索研究

ＯＲＦ完整的ＩＢＶ类Ｍ４１株Ｓ１基因ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＣＩ ＣＭＶ启动子下游我隆位点，构成ｐＣＩＳ１用于１周龄ＳＰＦ雏鸡的ＤＮＡ免疫试验。试验鸡生疏腿部肌肉注射ｐＣＩＳ１ＤＮＡ１００ｇ，２周后加强免疫一次。二次免疫２周后，代感染ＩＢＶ Ｈ５２株。结果，ＩＢＶ人工感染后第４天气管－泄殖腔棉拭子鸡胚病毒分离阳性者，免疫试验组为１／６，而对照组为６／６，鸡胚病毒中和试验显示，二次免疫后临感染前及     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)是严重危害养鸡业的重要病原之一.近年来国内外学者在分子生物学领域方面的研究不断深入,在病毒基因组的结构与功能及其N蛋白的研究方面取得了重要进展.对N蛋白如何特异性地识别病毒基因组RNA、参与病毒RNA的复制和包装、诱导IBV体液和细胞免疫应答的机制、IBV新型基因工程疫苗研制以及IBV的抗体水平监测等方面的研究,为IBV基因工程疫苗设计及其免疫防控提供了科学依据.     

IBV荧光定量PCR检测方法的建立及对感染鸡体内病毒的检测

IBV（infectious bronchitis virus）属于冠状病毒γ群，可以引起鸡的呼吸道疾病，造成严重的损失，现在对IBV诊断方法的研究进行得十分广泛，建立了多种方法。本研究建立了IBV的Real-Time PCR检测方法，最低检测灵敏度为10 copies/μL，可以有效地区别其他禽源病毒，板内差异为0.1%～0.7%，板间差异为0.7%～1.6%，证明该方法具有较高的灵敏性、特异性和稳定性，并对分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13进行了病毒感染试验的检测，在鸡体内的气管肺脏肾脏中都具有较高的浓度，其中气管和肾脏中病毒的滴度一直维持很高的水平，至感染后21 d才逐渐消失，病理组织学可见肾脏和气管病变最严重，证实了所分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13是具有很强毒力的肾型IBV毒株。     

RT—PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1整个S1糖蛋白基因（引物A）和S1糖蛋白基因N-端高变区I（引物B）的2对引物对3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及5个地方分离株（C60，D41A，D41B，A1121，A1171）进行RT-PCR扩增，用引物A时，有5个IBV毒株扩增到目的片段（1720bp)；用引物B时，所有8个IBV毒株均得到与预丈夫大小相符的目的产物（228bp)，对1720bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切，结果得出3个不同的RFLP图谱，其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HacⅢ酶切图谱，Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱；对228bp的PCR产物进行DdeI、RsaI限制性内切酶消化，根据它们的RFLP图谱，8个IBV毒株可分为5个基因型，综合2对引物的PCR产物的PCR产物的RFLP分析结果，8个IBV毒株可分为7个基因型，分型的结果与传统的血清学方法吻合，本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异灵敏等优点，为现场流行毒株的定型（基因型/血清型）及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

用单抗介导的交叉ELISA对IBV毒株的分型研究

用针对IBV 3种结构蛋白的一组单抗（C1、C2、C3、J1、J2、J3）和6个不同血清型的IBV标准株（Gray株、Connectic株、Holte株、T株、M41株、Arkavas株）进行交叉ELISA试验，显示了6种不同的反应模式；与同一Mass血清型内M41、H52、H120 3毒株进行交叉ELISA反应显示出相同的反应模式；通过地方分离株和标准株与6株单抗的ELISA反应模式比较可将来自河南、山东、江苏、广东、广西、西川等省22个地方株划分为7个不同的抗原群，其中M41抗原群占10株，其仍是我国当前主要的流行型。根据两株中和单抗C2、J1与22个地方株ELISA反应结果，可将地方株分为三大类群，即与J1反应的M41类群，与C2反应的Y类群和J1、C2均不反应的第三类群，C2和J1两株中和单抗可与85％以上毒株发生反应，可为IBV制苗毒株的选择（M41和Y）提供参考依据，此种分型方法较传统的分型方法简便、快速。     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。