鱼用三联口服疫苗的制备方法及其对大菱鲆的免疫效果

为探究海水养殖中安全可靠、经济适用的疫苗接种方法,以药用淀粉、麦芽糊精,以及经0.5%甲醛灭活的溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahemolyticus和迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda为主要原料,采用挤出-滚圆法制备鱼用三联口服疫苗,并用其对大菱鲆Scophthalmus maximus免疫,分别在免疫0、7、14、21、28 d时测定溶藻弧菌、副溶血性弧菌和迟缓爱德华氏菌特异性抗体,以1×109cfu/m L活菌(3种菌液比例为1∶1∶1)进行攻毒试验并计算免疫保护率。结果表明,药用淀粉150 g、麦芽糊精50g、菌液60 m L、挤出速度200 r/min、滚圆时间60 s时,为比较成熟的三联口服疫苗制备工艺,用该疫苗免疫大菱鲆后,3种细菌的大菱鲆血清和后肠黏膜抗体效价均显著高于对照组,且免疫保护率达50%以上。     

鱼肠道弧菌疫苗制备及免疫保护效果

本文比较了不同灭活剂及灭活条件对鱼肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）的灭活效果,确定以0.4%（v/v）福尔马林溶液在25℃下处理30h作为疫苗的最佳灭活条件,用灭活的鱼肠道弧菌疫苗免疫大菱鲆并测定了该疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio prarhaemolyticus）、鳗弧菌（Vibrio anguillarium）等的免疫保护力,结果表明,采用注射免疫方式接种后,针对鱼肠道弧菌的免疫保护率达75%;溶藻弧菌免疫保护率为67.6%;鳗弧菌免疫保护率为50%;副溶血弧菌免疫保护率为57.2%;采用浸浴免疫方式接种后,疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的免疫保护力分别为25%、22.3％、11.1%、12.5%。     

溶藻弧菌疫苗对黑鲷的免疫效果研究

用溶藻弧菌1.1587制备全细胞、全细胞 弗氏完全佐剂(FCA)、脂多糖(LPS)3种疫苗,疫苗经腹腔对黑鲷进行免疫注射,分别在第7、14、28、56 d采鱼血,检测抗体效价、白细胞吞噬活力、溶菌酶活力、SOD活力和抗菌活力;第28 d用5.5×108 cfu/mL的溶藻弧菌悬液进行攻毒试验来比较疫苗的免疫效果. 结果表明:抗体凝集效价在28 d达到最高值,免疫组2显著高于免疫组1和免疫组3(P《0.05);白细胞吞噬百分数和吞噬指数28 d达到最高值,3个免疫组都显著高于对照组(P《0.05);免疫组1和免疫组2溶菌酶活力在28 d达到最高值,显著高于对照组(P《0.05);SOD活力在28 d达到最高值,免疫组1和免疫组2显著高于对照组(P《0.05). 3种疫苗对黑鲷攻毒后20 d的免疫保护率分别为71.4%、85.7%、71.4%. 全细胞-FCA疫苗对黑鲷的免疫效果最好.     

基于Iclp的拟态弧菌OmpUAP真核表达重组质粒的构建及其免疫效果初步评价

为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。     

浸泡免疫预防草鱼细菌性烂鳃病效果的研究

用酚灭活的柱状嗜纤维菌和从该菌体提取的菌体脂多糖浸泡接种２０～２５ｇ的草鱼鱼种，共浸泡２次间隔一周。通过检测受免鱼体血清、肠和体表粘液中凝集抗体效价、血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用活菌攻毒的方法，探讨了浸泡免疫接种疫苗对预防草鱼细菌性烂鳃病的效果。结果表明，受免鱼体与对照鱼相比，血清、肠和体表粘液中凝集抗体效价和血液中吞噬细胞的吞噬活性都有明显上升。经活菌攻毒后，酚灭活柱状嗜纤维菌疫苗免疫组免疫保护率达３０％，而脂多糖疫苗免疫组免疫保护率为５５％。     

硫酸化多糖复方和中药成分复方的鸡新城疫疫苗免疫增强效果比较

为了筛选增强免疫效果最好的硫酸化多糖复方和中药成分复方,以前期筛选出的硫酸化黄芪多糖sAPS60、硫酸化淫羊藿多糖sEPS5和硫酸化香菇多糖sLNT2组成4个复方:复方1(sEPS-sAPS)、复方2(sEPS-sAPS-sLNT)、复方3(sAPS-sLNT)、复方4(sEPS-sLNT),以及前期筛选的2个中药成分复方--复方5(EPS-PF)和复方6(APS-GS),在14日龄雏鸡接种新城疫苗时注射,分别于免疫前和免疫后7、14、21 d,每组随机抽取6羽雏鸡翼下静脉采血,用β-微量法检测血清HI抗体效价;于免疫后14、21 d每组随机抽取4羽心脏采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖;于免疫后23 d各组用新城疫病毒攻毒,攻毒后14 d统计发病率、死亡率和免疫保护率,并测定血清抗体效价.结果表明,各复方均能明显或显著提高新城疫疫苗的免疫应答,提高血清HI抗体效价,促进淋巴细胞增殖,降低攻毒后的发病率和死亡率,提高免疫保护率.复方1和复方5的作用最为显著,可分别作为硫酸化多糖复方和中药成分复方免疫增强剂的候选方.     

鸡新城疫活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护结果相关性试验

为研究鸡新城疫活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护结果相关性,试验分别通过血清学和免疫攻毒两种方法测定了疫苗对试验鸡只的免疫效力。结果表明,疫苗免疫鸡只的血清HI抗体效价与抗攻毒保护呈现正相关。当鸡新城疫血清HI抗体效价达到5.0 log2时,攻毒保护率为100%,此时可认为疫苗对鸡新城疫病毒达到完全保护。为保证疫苗质量,建议鸡新城疫血清HI效价5.0 log2时,可判定疫苗效力检验合格。     

硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响

试验Ⅰ:免疫应答试验:取450只雏鸡随机均分为9组,在14日龄用新城疫Ⅳ系疫苗免疫,同时分别肌肉注射高、低剂量的3种硫酸化香菇多糖(sLNT_1、sLNT_2、sLNT_3)和香菇多糖(LNT)。分别于首免前和首免后连续6周检测血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的动态变化。试验Ⅱ:免疫保护试验:取350只雏鸡随机均分为7组,除非免疫组外其余组用新城疫Ⅳ系疫苗免疫,同时3个sLNT组和LNT组分别注射sLNT_1、sLNT_2、sLNT_3和LNT。于免疫后第21天,除无佐剂对照组第2组外各组鸡均肌肉注射NDV强毒攻毒,观察保护效果,并分别于攻毒前和攻毒后第3、6、9、12和15天测定血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的动态变化。结果表明:3种sLNT在首免后28 d内比LNT显著提高血清抗体效价最高2个滴度(高剂量的效果优于低剂量),促进淋巴细胞增殖(低剂量的效果强于高剂量);攻毒鸡发病率和死亡率降低,保护率提高最多达17.5%,加速攻毒后血清抗体生成和T淋巴细胞增殖,病鸡最快可以在攻毒后6 d恢复正常。综合评价以sLNT_2的效果最好。揭示:硫酸化修饰能显著提高LNT的免疫增强活性,增强新城疫疫苗的...     

大黄鱼溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs的免疫效果初步研究

以溶藻弧菌外膜蛋白为模式抗原,制备其ISCOMs,免疫大黄鱼,进行安全和免疫力试验测定,结果显示溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全、纯净;免疫组菌体凝集效价比对照组高,但免疫组个体间有差异,而免疫组的血清ELISA抗体水平明显高于对照组;攻毒试验组（O．3×10^7个·尾^-1）存活率可达100％,对照组（0．3×10^7个·尾^-1）存活率为20％;试验表明溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全,免疫大黄鱼后可产生免疫保护力。     

哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系

采用不同血清型哈维氏弧菌Vibrio hanwyi624、809和106等3个菌株，制备成福尔马林灭活菌苗，注射接种大黄鱼4周后，通过血清中凝集、交叉凝集抗体效价测定以及活菌攻毒试验，证明了3个菌株制备的菌苗抗原性存在差异。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶（trxR）基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a（＋）/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

哈维氏弧菌灭活疫苗在养殖大黄鱼中的应用与评价

将分离自大黄鱼Pseudosciaena crocea的病原菌GYC1108-1,在体积分数为0.5%的福尔马林溶液中灭活24 h,制成灭活全菌苗（细菌含量为6×109cfu/mL）;用该灭活菌苗分别免疫小白鼠和大黄鱼,并检测小白鼠和大黄鱼血清中抗体效价及疫苗对鱼体的免疫保护力。结果表明：小白鼠经注射疫苗后28 d,血清中抗体效价最高达1∶4 000,大黄鱼经注射和浸泡免疫后,血清中最高抗体效价分别为1∶1 280和1∶320,免疫保护率分别为75%和65%;抗GYC1108-1的抗体与不同种属细菌间存在着交叉反应,其分类地位越近,交叉反应也越大;用研制的疫苗开展大黄鱼生产性免疫预防试验,受免疫组鱼存活率有较大提高,分别为85%和86%,而未免疫组鱼存活率仅有70%,表明疫苗可有效防治养殖大黄鱼细菌性病害。     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

梭子蟹乳化病的间接ELISA诊断

以梭子蟹乳化病的病原菌-溶藻弧菌为抗原,制成免疫血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗、建立了检测溶藻弧菌的间接ELISA快速诊断法。结果表明,应用间接ELISA技术检测溶藻弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为104cfu/mL。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。人工感染试验48 h后,就能在血淋巴和鳃中检测到溶藻弧菌。应用建立的间接ELISA法进行现场检测,表观有病蟹的阳性检出率为90%,表观健康蟹的阳性检出率为20%,养殖海水中没有阳性检出。     

出口冻虾仁中多次检出溶藻弧菌的报告

[目的]了解和掌握奉化地区出口冻虾仁的溶藻弧菌污染情况。[方法]采集冻虾仁标本按照SN0173-92分离溶藻弧菌。[结果]从35批冻虾仁出口样品中,检测出溶藻弧菌菌株21批,检出率高达61.76%。[结论]冻虾仁中溶藻弧菌携带率很高,应引起相关部门重视,企业应采用切实有效的杀菌方法,谨慎选择原料捕捞季节和海区。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

溶藻弧菌适配子亲和力测定条件的优化及其特异性研究

[目的]优化溶藻弧菌适配子亲和力的测定条件,并验证适配子的亲和特异性。[方法]采用地高辛-过氧化物酶显色系统,通过正交试验确定亲和力测定的适宜条件,并在该条件下进行特异性验证。[结果]优化后亲和力的测定条件为：菌浓度3.0×10^8个/ml,结合时间40 min,结合温度28℃;经验证,该适配子对溶藻弧菌具有较高的亲和特异性。[结论]获得了溶藻弧菌适配子亲和力测定的优化条件,并证明了该适配子与溶藻弧菌具有较好的亲和特异性,为溶藻弧菌的SELEX筛选及其快速检测提供了参考。     

几种鸡新城疫油佐剂灭活疫苗免疫效果的比较

比较研究了鸡新城疫(ND)二价灭活苗、ND灭活苗、进口ND灭活苗、ND强毒(CNDV)灭活苗和ND克隆-30弱毒苗的免疫效果。结果表明,不同ND疫苗首次免疫鸡所产生的抗体有差异,ND二价灭活苗免疫鸡的抗体上升最快,免疫后20 d左右可达到最高峰。1日龄免疫,14日龄攻毒,ND二价灭活苗、ND灭活苗的保护率分别为5/5,4/5;10日龄和10日龄以上免疫,免疫后7 d或7 d以上攻毒,ND二价灭活苗、ND灭活苗、进口ND苗的保护率分别为4/5~5/5,2/5~5/5,0/5~2/5。攻毒后ND二价灭活苗、进口ND灭活苗免疫的与对照鸡的肛棉拭子NDV阳性数分别为0/5,5/5,5/5。结果表明,ND二价灭活苗免疫效果优于进口ND灭活苗、ND强毒灭活苗,稍优于ND灭活苗。     

水产品中弧菌的PCR技术检测研究进展

水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌均是食源性致病菌,对这些菌种灵敏、快速的检测方法对水产品安全以及保护人类健康极为重要.主要综述了水产品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的分子生物学检测研究进展.