鱼类细胞培养技术研究进展

鱼类细胞培养技术是一种重要且有潜力的生物学研究技术手段和方法。随着生物技术的发展,越来越多的鱼类细胞系(株)被建立。鱼类细胞培养的具体方法因细胞种类而异,但是总体上有共同之处。作者针对鱼类细胞培养的发展现状、应用与特点、方法技术进行综述,并为鱼类细胞培养的发展前景作出展望。     

鱼类细胞培养在渔业科学上的应用

<正> 自1962年Wolf和Quimby首次建立RTG-2细胞系以来,鱼类细胞培养技术有了很大进展。据Wolf和Mann1980年的统计已有17属36种鱼61个硬骨鱼类细胞系相继建立。我国这方面工作起步较晚,主要是近10年的工作,但已建立了草鱼吻端组织细胞株(1981,张念慈杨广智),草鱼肾组织细胞系(1986,左文功等),草鱼尾鳍组织二倍体细胞系(1986,魏彦章等),草鱼吻端成纤维细胞系(1988,李焕林等)十余种细胞株(系)。建立细胞株(系)的目的旨在运用这一技术进行其它领域研究。从已发表的文献来看,鱼类细胞培养技术已用于鱼类遗传育种,鱼病防治,鱼类生理学,环境保护等领域的研究。本文就此作一概述。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用。本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SVCV)在该细胞中的增殖特性等进行了研究。结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10%。测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性。生长曲线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖。结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究。GCO细胞的适宜生长温度为15–28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离。     

淡水鱼类细胞培养方法

<正> 鱼类细胞培养研究大约已有三十年历史。自Clem等(1961)建立的GF-1细胞株问世以来的有关统计,到1979年为止国外相继报告来自冷水性和温水性真骨鱼类组织的细胞系已有61种,现在业已大大地超过了该数字。我国鱼类细胞培养研究开始于70年代,1981年张念慈和杨广智报告了草鱼吻端组织二倍体细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S_1的建立,同年台湾省陈秀男和郭光雄亦报告建立了鳗鱼卵巢组织细胞系,陈秀男等(1982、1983)还先后报告建立了鳗鱼肾脏组织和罗非鱼卵巢组织的细胞系,左文功等(1986)报告了草鱼肾脏组织细胞系CIK的     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用.本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SvCv)在该细胞中的增殖特性等进行了研究.结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10％.测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性.生长盐线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖.结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究.GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离.     

国外传染性造血器官坏死病的研究概况（3）

Clark和Soriano曾报导了一些有趣的工作。他们描述了IHN病毒及两种其它鱼类的病毒(SVC和VHS)在非鱼类细胞培养物中的复制现象。这些病毒能在人体两倍体细胞株WI—38，在BHK／21以及一种或多种爬行类动物的细胞系中杂制，并产生CPE。SVS和VHS病毒在BHK／21细胞中复制的最适温度与在变温脊椎动物细胞培养物中测得的结果相一致。作者们指出，     

草鱼肾脏组织细胞系CIK的建立(简报)

<正> 鱼类细胞系是研究鱼类病毒和细胞生物学的重要基础。自Wolf和Quimby(1962)报告建立RTG—2细胞系以后,国外相继报告来自冷水性和温水性鱼类组织的细胞系已有数十种。我国台湾省陈秀男和郭光雄(1981)曾报告建立了鳗鱼卵巢组织细胞系。陈秀男等(1982,1983)又先后报告建     

宽口裂腹鱼中肾组织细胞系建立的初步研究

鱼类细胞培养是进行种质保存、基因功能分析、细胞工程育种等研究的重要材料和模型。为了建立濒危的宽口裂腹鱼(Schizothorax eurystomus)中肾组织细胞系,本研究以其中肾组织为材料,以组织块移植法启动细胞原代培养,待细胞稳定后再进行传代培养,建立宽口裂腹鱼中肾组织细胞系,命名为EUM10。分析宽口裂腹鱼中肾细胞系冻存复苏能力和最适生长条件,且通过PCR技术检验污染状况,用线粒体基因片段分析鉴定细胞的来源。结果显示,宽口裂腹鱼中肾组织细胞的最佳培养基为DME/F-12,最适温度为25℃,最适血清浓度为20%;细胞呈悬浮生长,生长曲线为“S”型曲线,第10代中肾组织细胞系细胞的群体倍增时间为23.26 h;第6代细胞液氮冷冻保存6个月后,复苏存活率达91.91%;经污染鉴定无污染现象;EUM10第10代细胞线粒体16S rRNA序列分析结果与宽口裂腹鱼基因序列一致性为99.81%,表明细胞系来自宽口裂腹鱼。本研究成功建立了宽口裂腹鱼中肾组织细胞系,可将宽口裂腹鱼中肾细胞系作为体外体系运用于宽口裂腹鱼的研究,如细胞遗传学、基因功能分析等,可为宽口裂腹鱼的基础研究和育种工作提供基础资料。     

鱼类细胞系研究现状

鱼类细胞系是研究鱼类病毒学、生理学、毒理学、免疫学和分子遗传学的重要材料和重要的体外研究系统。鱼类细胞系的组织来源包括脑、心脏、鳃、肾脏、鳍条和卵巢等各种组织。目前已至少建立并应用了826株鱼类细胞系。本文综述了近年来鱼类细胞系的组织来源、培养方法及应用现状，旨在为鱼类细胞系研究提供最新的数据支撑。     

团头鲂骨组织细胞系的建立及其生物学特性

为研究鱼类骨组织细胞的特征,实验建立了团头鲂骨组织细胞的体外分离培养方法,并对其生物特性进行了鉴定。以3月龄团头鲂尾椎骨及肋骨为实验材料,利用组织块培养法和胰蛋白消化法分别进行骨组织细胞培养,确定最佳培养条件:采用组织块培养法,28°C培养,M-199培养基中加入体积分数为20%的胎牛血清、25 ng/m L表皮生长因子EGF和25 ng/m L碱性成纤维生长因子b FGF。细胞生物学特性鉴定结果显示:细胞碱性磷酸酶、钙化结节茜素红染色及矿化结节von Kossa氏法染色均呈阳性,表明所培养的细胞具有典型成骨细胞的生物学活性;鱼骨钙素ELISA试剂盒检测培养细胞中骨钙素含量为997.25 ng/L;荧光定量PCR结果显示特异性调节成骨细胞分化的转录因子runx2a、runx2b和osterix基因在团头鲂骨组织细胞系中均有表达,且runx2b和osterix的表达量显著高于团头鲂肌肉细胞系。利用本方法可获得增殖活性良好,生长速率快,且细胞生物学特性稳定的团头鲂骨组织细胞系(MBCs),为日后鱼类骨组织体外实验研究奠定了基础。     

鱼类细胞株在病毒分离培养中的应用

<正>一、鱼类细胞株1.鱼类细胞株鱼类细胞培养需要从水产动物体上获取组织,使用特定的培养液进行培养,最终获得细胞的稳定培养物,这个过程通常需要数个月以上,称为细胞的建株。获得的培养形态、特征一致的细胞称为细胞株或细胞     

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。     

细胞培养技术的发展动态及其动物克隆技术研究进展

细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来发展起来的核移植、细胞杂交、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立,也都需要与细胞培养紧密结合。鱼类细胞培养也是开展鱼类病毒性病原、疫苗制备和鱼类细胞工程等研究的基础,     

鱼类细胞系的核型演化

鱼类细胞系的染色体可自然发生变异或受环境条件影响发生变异。在一个成熟的细胞系中会发生成千上万的染色体变异。而这些变异不会影响到细胞系的存活。从细胞遗传学观点出发，比较in uitro和生物体核型的进化是很有意义的。然而目前尚很少有关于鱼类细胞系核型演化的研究报道。本研究分析比较了RTA（虹鳟幼鱼细胞系），RTO（虹鳟卵巢细胞系）CHSE－214（大鳞大麻哈胚胎细胞系）等三个处于不同培养阶段的鱼类细胞系的染色体变异。CHSE－214的模式染色体数为62和64，其变异幅度为39－123。RTA的模式染色体数为110－115，变异幅度为27－400。在第17代时，RTO的模式染色体数为60，其变异幅度已达到41－128。所有三个细胞系均为异倍体系。一个巨形细胞，核内包括超过2000条以上的染色体在CHSE－214中出现，其染色体数大于模式细胞30多倍，其倍性超过64倍体。在CHSE－214和RTA中双着丝点染色体，环状、断片、微体、缺失、交换等染色体变异很高。在RTO的最初几代（五代以前），几乎没有染色体数量和结构变异。第十代以后，染色体数量变异幅度已经很高，超过50％。在RTA和CHSE－214中，还发出了大量的具有不规则细胞核，细胞由许多微核构成，细胞核中间具有园孔，细胞微核之间具有桥型物连接的细胞，还发现有多极纺锤形，核内有丝分裂细胞和呒纺锤丝的丝分裂细胞。这些变异可能是细胞系染色体数量变异的原因。本还用Q－带，DAPI－带和G－带技术进行了三个细胞系的核型分析，发现CHSE－214具1－4条特异染色的染色体，这可能是该细胞系所具有的特异标志。     

i大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗研制成功

9月下旬,中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害研究室与鱼类养殖与育种研究室的科研人员在前期成功分离大鲵病毒性出血病病原——大鲵虹彩病毒的基础上,又成功研制出大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗。这项研究已经建立了细胞大规模培养、病毒大量增殖、病毒灭活的方法,灭活疫苗已经通过细菌检验、细胞培养安全性试验与鱼体安全性试验。疫苗的免疫保护效力试验正在进行中。     

鱼类细胞培养的研究与应用

21世纪是生命科学的世纪,也是海洋科学的世纪。随着生命科学理论和技术的飞速发展,细胞培养技术的地位和作用也越来越突出了,哺乳动物细胞培养的研究起步较早,目前已经取得了丰硕的成果,而水生动物特别是鱼类细胞培养的研究起步较晚,相对来说是比较滞后的,但是其发展也是非常迅猛的,并且有着广阔的应用前景。本文针对鱼类细胞培养的发展与现状、方法与技术及其在科学研究中的应用等方面进行了综述,并对鱼类细胞培养的发展前景作了展望。     

鱼类种质保存研究进展

开展鱼类种质保存的研究,不仅可以保护鱼类种质资源和生物多样性,而且也是对鱼类种质资源进行有效开发和利用的前提条件。目前鱼类种质保存包括分子(DNA)保存、细胞保存和活体保存等。其中,分子(DNA)保存按照技术难易程度分为基因组DNA保存、基因组文库保存、cDNA文库保存、DNA芯片保存4种;细胞保存一般可分为配子保存、胚胎保存、细胞系保存3种;而活体保存按鱼类生长环境不同可分就地保护和易地保护2种。综述了多种海、淡水鱼类种质保存的研究现状与进展,包括鲤科、鲆科、鲷科、鲱科以及鲽科等科鱼类种质保存的具体情况,为我国鱼类种质保存提供参考资料,同时对今后鱼类种质保存研究提出了展望。     

鳗鲡疱疹病毒的生物学及理化特性

为了明确鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的生物学及理化特性,本实验利用一株从欧洲鳗鲡"脱黏败血综合征"病料中分离的AngHV病毒株,研究了其增殖特性及其对主要鱼类细胞系的感染敏感性,进一步分析了其对热、酸碱、氯仿和乙醚等理化因子的耐受性。结果发现,AngHV感染的鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)内可见典型的疱疹病毒样颗粒,细胞出现时序性细胞病变;AngHV可在EO细胞系内稳定传代,较适宜扩繁温度为25～27°C,不能在鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papilloma cyprinid cell line, EPC)、草鱼卵巢细胞系(grass carp ovary cell line, CO)、胖头逓肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM)、大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(chinook salmon embryo cell line,CHSE-214)、虹鳟性腺细胞系(rainbow trout gonad cell line, RTG-2)及蓝鳃太阳鱼细胞系(bluegill fry cell line, BF-2)等鱼类细胞内增殖;理化特性分析表明,37°C处理30 min,AngHV滴度降低不明显,而56°C处理30 min可完全灭活AngHV;AngHV对酸(pH 3.0)敏感,而对碱(pH 10.0)较耐受,同时对氯仿和乙醚敏感。本研究结果可为AngHV的综合防控及疫苗的开发提供参考依据。     

对虾细胞培养的研究现状

对虾的细胞培养，是研究对虾不同学科和领域的重要工具之一，至今，国内外已有不关于对虾细胞培养的研究报道，本文综述了不同作者对不同对虾细胞原代培养的结果，比较了其培养方法和培养条件的异同；描述了研究尝试多种方法对原代细胞的传代培养，其中一些方法对对虾细胞系的建立起到了积极的作用，介绍了利用细胞培养技术在对虾不同领域的应用状况，尤其是对对虾病毒性疾病的研究方面应用较多。     

齐口裂腹鱼鳃丝细胞系的建立、鉴定及免疫研究

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)是长江上游水域的珍稀鱼类, 近年来由于环境变化和疾病爆发野外齐口裂腹鱼数量急剧减少, 现已被列入长江上游二级急切保护的特有鱼类, 因此, 对齐口裂腹鱼的保护刻不容缓。建立齐口裂腹鱼细胞系是保护其种质资源的有效手段, 也可以在不伤害现有鱼群的条件下进行多种齐口裂腹鱼相关生物学研究。本研究建立了首个来源于齐口裂腹鱼的细胞系, SPG 细胞系。原代细胞分离自齐口裂腹鱼鳃丝组织, 呈均一的上皮状, 使用含 15%血清的 L-15 培养, 在 15 个月时间里成功传至 55 代。线粒体 COI 基因鉴定, 证明该细胞来源于齐口裂腹鱼, 核型检测细胞染色体数目为 2n=96。在液氮中保存 12 个月的细胞, 复苏后能保持 75%以上活力。EGFP-N3 质粒转染 SPG 细胞后观察到明显的绿色荧光蛋白表达。病毒类似物 poly(I:C)和大肠杆菌脂多糖 LPS 可引起细胞 IL-1β、IL-8、TNFa 和 TLR22 等免疫相关基因表达量升高。表明本研究建立的齐口裂腹鱼鳃丝细胞系可用于免疫学研究。此外, 此细胞系还将在种质保存, 外源蛋白表达和齐口裂腹鱼体外生物学研究中发挥重要作用。