利用响应面法优化鳗弧菌载体疫苗MVAV6203A-1冷冻干燥保护剂配方

应用单因素试验、复合保护剂组合试验和响应面分析法,对鳗弧菌载体疫苗MVAV6203A-1冷冻干燥的保护剂配方进行筛选和优化。试验结果表明,众多保护剂中半乳糖、海藻糖和脱脂牛奶的组合使用,能够显著提高细胞对冷冻干燥环境的耐受力。以冻干后的细胞存活率为响应值,响应面法优化的结果为:半乳糖4.6%、海藻糖2.3%、脱脂牛奶10.2%,以优化的最佳配方进行的3次重复冻干试验,细胞平均存活率可达77.3%。优化的保护剂配方适用于鳗弧菌载体疫苗的冻干生产。     

芽孢杆菌对草鱼生长和肠粘膜抗氧化功能及养殖水质的影响

本试验研究了饲料中添加芽孢杆菌对草鱼生长、肠粘膜抗氧化功能及养殖水体水质的影响。选取平均体重为（51.0±2.3）g的健康草鱼300尾,随机分成3组（对照组、处理组1和处理组2）,每组3个重复,每个重复50尾鱼。其中对照组饲喂基础日粮,处理组1和2分别饲喂含复合芽孢杆菌（105 cfu/克饲料,枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌以1:1比例混合）和枯草芽孢杆菌（105 cfu/克饲料）的基础日粮。试验期为45d。结果表明,饲料中添加芽孢杆菌对养殖水体pH和硝酸盐氮含量无显著影响,但显著降低了从第21d到试验结束期间水体中亚硝酸盐氮的含量（处理组1第35d除外）。芽孢杆菌的添加同时显著降低草鱼的死亡率（P<0.05）,并提高了草鱼的增重率和特定生长率。与对照组相比,处理组1和2草鱼的增重率分别提高了52.93%（P<0.01）和21.78%（P<0.05）,特定生长率分别提高了44.44%（P<0.01）和16.67%（P<0.05）;而且处理组1草鱼增重率和特定生长率分别比处理组2提高了25.58%（P<0.01）和23.81%（P<0.01）。肠粘膜抗氧化活性研究表明,与对照组相比,饲料中添加芽孢杆菌能提高草鱼肠粘膜超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。以上结果提示,饲料中添加芽孢杆菌可以改善养殖水质和草鱼肠粘膜抗氧化功能,并显著促进草鱼生长并降低死亡率。     

地衣芽孢杆菌De在优质草鱼养殖中的应用研究

运用综合对比分析法探讨了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis De在优质草鱼（Ctenopharyngodon idellus）养殖中的应用效果，其评价指标分别为成活率、水体pH、透明度、溶解氧及水中氨氮、硝酸盐浓度等。结果表明，施用地衣芽孢杆菌De可在一定程度上使水体环境和养殖生产性能得到优化，提高养殖草鱼的成活率，显著降低水体透明度及水中氨氮、硝酸盐含量（P〈0．05），使水体pH、溶解氧有利于草鱼的生长。其中施菌组较对照组的成活率、水体pH、溶解氧分别提高了3．2％、3．9％、25．5％，而水体透明度、氨氮及亚硝氮浓度则分别降低了38．5％、74．6％、69．3％。     

微生态制剂在克氏原螯虾生态养殖中的应用试验

为了解复合芽孢杆菌微生态制剂对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)养殖池塘水质及螯虾成活率的影响,设计了3组试验塘(使用复合芽孢杆菌)和3组对照塘(未使用复合芽孢杆菌)进行92d的养殖对比试验。结果表明,试验塘总体水质优于对照塘,与对照池相比,试验池氨氮含量显著降低了69.6%,亚硝酸盐含量显著减少了54.5%,透明度显著降低了23.5%,pH值和电导率变化显著(P<0.05),试验塘克氏原螯虾成活率显著提高了12.8%,养成规格显著增加了27.8%,生长率显著高于对照塘(P<0.05)。研究表明,浓缩复合芽孢杆菌微生态制剂对养虾池塘的水质具有一定的净化效果,并可通过调节螯虾免疫系统减少病害发生,提高螯虾养殖成活率。     

海洋侧孢短芽孢杆菌S-12-86溶菌酶的分离纯化与冻干技术研究

海洋微生物溶菌酶发酵液经低温离心、超滤浓缩、乙醇提取、Superdex 75 10/300凝胶层析和反相高效液相色谱层析纯化得到电泳纯海洋溶菌酶,分子量为17.1 kD,比活达到3 987.7 U/mg,纯度提高41.98倍,活力回收率为21.7%。对该酶冷冻干燥过程的研究结果表明,海藻糖、蔗糖和麦芽糖对该酶均有一定的冻干保护作用。其中,以海藻糖的保护效果最佳。0.5 mol/L海藻糖与20 mg/ml吐温80复合作为冻干保护剂,使冻干后的溶菌酶活性维持在95%以上,为该酶进一步研究和应用提供了稳定的酶制剂。     

微生态制剂对河蟹养殖成活率的影响

为了进行河蟹生态健康养殖技术的示范推广,研究了一种微生态制剂对河蟹养殖池塘水质及河蟹成活率的影响。结果显示,使用含浓缩复合芽孢杆菌的微生态制剂(主要成分为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌)的试验池水质优于对照池。与对照池相比,水体透明度增加26.1%,溶解氧降低22.6%,pH下降5.5%,电导率下降26.0%,氨氮含量降低75.1%,亚硝酸盐含量减少51.4%,河蟹养殖成活率提高了11.5%,河蟹养成规格提高25.0%。研究表明,浓缩复合芽孢杆菌微生态制剂对养蟹池塘的水质具有一定的净化效果,并可通过调节河蟹免疫系统减少病害发生,提高河蟹养殖成活率。     

复合芽孢杆菌对草鱼与鲢鳙混养的鱼种池水质的净化作用

试验池面积0.53hm2,池深2.5m,每0.067hm2放养全长3cm草鱼Ctenopharyngodon idellus 0.31万尾、鳙Aristichthys nobilis 0.11万尾、白鲢Hypophthalmichthys molitrix 0.11万尾,每15d泼洒复合芽孢杆菌Bacillus;对照池面积0.667hm2,池深2.5m,每0.067hm2放养草鱼0.29万尾、鳙0.15万尾、白鲢0.15万尾,不泼洒复合芽孢杆菌。在泼洒复合芽孢杆菌3d后,检测试验池和对照池水质,研究复合芽孢杆菌对水质净化的作用。结果表明:试验池塘全年COD、氨氮和非离子氨水平分别比对照池低6%、18%和41%,而透明度(28%)和溶解氧则增加。复合芽孢杆菌对养鱼池塘水质具有明显的净化作用。     

一株短小芽孢杆菌B1的筛选鉴定及其抗菌特性研究

为筛选抗水产弧菌的益生菌株,自西沙海域采集的珊瑚和海水样品共分离到125株细菌,从中筛选出1株无溶血性且对多株病原菌具有拮抗作用的海洋细菌B1。基于生理生化及16SrDNA序列鉴定海洋细菌B1为短小芽孢杆菌。以副溶血弧菌13150为病原指示菌,用琼脂扩散法测定发酵液抑菌活性,并通过卤虫浸泡方式和药敏试验方法检测短小芽孢杆菌B1的安全性,同时进行温度、酸碱度、盐度的发酵条件优化研究。试验结果显示,短小芽孢杆菌B1对副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等有显著的拮抗作用;共培养试验显示,加入等量短小芽孢杆菌B1无菌上清液可显著抑制副溶血弧菌的生长;安全性试验发现,短小芽孢杆菌B1对卤虫的72h半致死密度为108cfu/mL,副溶血弧菌13150的72h半致死密度为105cfu/mL。此外,药敏试验表明,短小芽孢杆菌B1只对20种常规抗生素中的5种产生抗性;优化后的短小芽孢杆菌B1发酵条件为:温度30℃,pH 7.0,NaCl质量分数为2%。研究表明,短小芽孢杆菌B1具有防治水产养殖病原弧菌的应用潜力。     

全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。     

基于崩解时限的牡蛎糖原片剂配方组合优化研究

为了确定牡蛎糖原片剂的制备工艺,以崩解时限为重要指标,利用单因素结合正交试验法筛选优化牡蛎糖原片剂配方组合。研究结果表明,以牡蛎糖原冻干粉添加量15%、微晶纤维素15%、麦芽糊精5%、羧甲基淀粉钠5%、硬脂酸镁0.02%、玉米淀粉59.98%为片剂处方,优选出的处方工艺简单可行,制备的片剂质量符合中国药典(2015版)的有关规定,稳定性好。     

饲料中添加复合芽孢杆菌对草鱼消化道酶活性及肠道菌群的影响

用含复合芽孢杆菌(105cfu/g饲料,枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌以1∶1比例混合)的基础日粮,按体重3%的日投饵量,饲喂体重(51.37±0.58)g的草鱼(Ctenopharyngodon idellus),饲养实验45 d。结果表明:与对照组相比,处理组肠道内容物胰蛋白酶活性提高了79.46%(P<0.01);肝胰腺脂肪酶活性提高了16.82%(P<0.01),肝胰腺淀粉酶和胰蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)。肠道菌群数量分析显示,处理组肠道芽孢杆菌数均显著提高(P<0.01),弧菌和大肠杆菌数显著降低(P<0.01)。结果提示,饵料中添加复合芽孢杆菌能够改善草鱼肠道菌群组成,并提高消化道特定消化酶活性。     

仔猪肠源枯草芽孢杆菌体外耐受性研究

研究了分离的仔猪肠源枯草芽孢杆菌体外耐受性。以枯草芽孢杆菌的存活率为考察指标,通过耐酸性、耐胆盐、耐高温试验来研究菌株的体外培养特性。结果:耐酸性试验中枯草芽孢杆菌在p H为2.0的培养基中培养3 h的存活率仍能达到64.7%;耐胆盐试验中其在0.1%和0.3%胆盐培养基中培养8 h存活率均在60%以上;耐高温试验中,70℃、90℃和100℃对其处理20 min存活率分别为70.4%、29.3%和0.2%。结果表明:仔猪肠源枯草芽孢杆菌对酸及胆盐有较强耐受性,对高温有一定耐受性,试验为进一步研制仔猪肠源枯草芽孢杆菌制剂研究提供参考。     

罗非鱼无乳链球菌拮抗株的筛选及特性研究

自吉富罗非鱼养殖池塘水体、底泥和鱼体肠道中筛选无乳链球菌拮抗株。对其中1株抑菌能力最强的菌株LT3-1进行溶血性、形态、生理生化、16S rRNA基因序列测定,并进一步对其抑菌活性与发酵时间的关系、抑菌物质对温度的耐受性、产酶性能、降解亚硝酸盐性能、药物敏感性、安全性试验、攻毒试验进行研究。鉴定结果表明,菌株LT3-1为枯草芽孢杆菌,无溶血性。液体发酵16 h时,抑菌活性最强,抑菌圈平均直径为(25.30±0.57) mm。随温度的升高抑菌活性下降,但仍然存在,说明抑菌物质有耐高温特性。枯草芽孢杆菌LT3-1具有水解蛋白、淀粉和纤维素的能力。亚硝酸盐降解试验表明,枯草芽孢杆菌LT3-1菌液密度为10^5 cfu/mL时,6 h即可将亚硝酸盐质量浓度由2.5 mg/L降至0.03 mg/L,降解率达98.8%( P <0.05)。枯草芽孢杆菌LT3-1对检测的9种抗生素均敏感,罗非鱼接种密度为10^7 cfu/mL的枯草芽孢杆菌LT3-1菌液200 μL后,仍然存活且未有异常表现。动物攻毒试验表明,添加0.05%枯草芽孢杆菌LT3-1菌粉的试验组罗非鱼存活率提高20%,显著高于对照组( P < 0.05 )。综上所述,筛选自吉富罗非鱼肠道的枯草芽孢杆菌LT3-1能有效拮抗罗非鱼无乳链球菌,可以作为防治当地罗非鱼无乳链球菌病的良好菌种资源。     

草鱼病原菌AvX005的分离鉴定及其拮抗菌筛选研究

2016年4—7月,湖南望城乔口渔场爆发了较大范围的草鱼疾病,自爆发病的草鱼病变组织中进行细菌分离与培养,分离得到一株优势菌,回复感染试验测定,该菌株具有较强的致病性。经菌落形态观察、冷场扫描电镜观察、生理生化试验及16SrDNA基因序列同源性分析,鉴定为维氏气单胞菌,编号为AvX005(GenBank登录号:KU64116.1),在此基础上以维氏气单胞菌AvX005为指示菌,通过点种法和纸片扩散法筛选拮抗菌,拮抗试验发现新筛选的解淀粉芽孢杆菌对维氏气单胞菌AvX005有较好的拮抗效果,采用酸沉淀、C18反相柱色谱分离到抑菌活性物,LC-MS/MS鉴定分子量为1045.29。根据抑菌活性物的理化性质,初步确定解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌活性物可能为脂肽类化合物。该研究不仅可为快捷、准确检测由维氏气单胞菌引起的鱼类疾病提供参考及填补国内维氏气单胞菌拮抗菌在分类地位、生物学特性等方面的不足,而且也为我国草鱼维氏气单胞菌病的生物防治提供科学资料。     

抗菌肽$807对水产动物的生物活性研究

为测定抗菌肽S807（强生肽）对水产动物抗病、促生长功效以及生产应用价值。首选药敏试验结果表明,抗菌肽S807对大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌Cowan I和枯草芽孢杆菌最小抑菌菌浓度分别为0．78、3．12和6．25μg/mL。选择大黄鱼、真鲷、白鲢、草鱼、花鲢鱼和青虾为实验动物,在基础日粮中添加强生肽S807150mg／kg。监测实验鱼虾成活率、日增重、饵料投入比等生产性能比较指标。结果显示,抗菌肽S807对实验鱼虾成活率平均提高10％以上,青虾养殖效果显著。     

芽胞杆菌益生菌在水产业的应用

芽孢杆菌被认为兼有改善水生动物消化道和改良水环境的双重功效而受重视。文中阐述了益生菌在水产养殖中应用的最新理论、技术和趋势,包括运用分子生物学方法进行菌株的分型鉴定和安全性检测,对病原菌和病原性病毒的拮抗试验,以及一系列的大田养殖试验,以验证芽胞杆菌益生菌产品在水产上尤其是在大型养虾场应用的功效。     

一株具水霉抑制特性的芽孢杆菌筛选及其分子生物学鉴定

以水霉菌(Saprolegnia ferax)的生物防治为切入点,通过对本实验室保存的9株芽孢杆菌(Bacillus spp.)与水霉菌JL菌株进行对峙拮抗试验,筛选出具有明显抑制水霉菌JL菌株的芽孢杆菌BA1(P<0.05)。经进一步测定菌株BA1对不同来源水霉菌株试验,结果显示菌株BA1对水霉菌株6#、10#、S2也有明显的抑制作用(P<0.05)。通过测定菌株BA1的16 S rDNA,利用BLAST软件进行同源性比对,发现与蜡样芽孢杆菌的同源性在99%以上。由此推测,菌株BA1为蜡样芽孢杆菌菌株,且具有明显抑制水霉菌作用,可以作为水产养殖上水霉病防治的生物制剂使用。     

斑点叉尾“腹水症”病原的分离鉴定及体外芽孢杆菌拮抗试验

为了解斑点叉尾(Ictalurus punctatus)"腹水症"的发病原因,提高防控技术,试验在佛山市某渔场患典型"腹水症"的病上分离出优势菌落,通过形态学观察、生化及分子生物学鉴定确定该细菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。通过对健康斑点叉尾的回归感染实验发现,与原感染鱼发病症状相似,且分离鉴定得到相同病原菌。体外药敏试验结果显示:该温和气单胞菌菌株对恩诺沙星、氟苯尼考等7种药物敏感,而对四环素、强力霉素耐药。本研究还探讨了4种芽孢杆菌对分离的温和气单胞菌的拮抗作用,结果表明地衣芽孢杆菌对该病原的拮抗作用最好。     

斑点叉尾(鮰)"腹水症"病原的分离鉴定及体外芽孢杆菌拮抗试验

为了解斑点叉尾(鮰)(Ictalurus punctatus)"腹水症"的发病原因,提高防控技术,试验在佛山市某渔场患典型"腹水症"的病(鮰)上分离出优势菌落,通过形态学观察、生化及分子生物学鉴定确定该细菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria).通过对健康斑点叉尾(鮰)的回归感染实验发现,与原感染鱼发病症状相似,且分离鉴定得到相同病原菌.体外药敏试验结果显示:该温和气单胞菌菌株对恩诺沙星、氟苯尼考等7种药物敏感,而对四环素、强力霉素耐药.本研究还探讨了4种芽孢杆菌对分离的温和气单胞菌的拮抗作用,结果表明地衣芽孢杆菌对该病原的拮抗作用最好.     

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究：生产性免疫试验

用草鱼出血病细胞培养灭活疫苗(CFRV疫苗)在较大的范围内对草鱼进行免疫试验,通过五种不同的草鱼放养方式以及二种疫苗给予途径的比较观察,证实CFRV疫苗在生产上有广泛的应用性。试验结果表明,一龄草鱼种使用CFRV疫苗后成活率比对照纽提高25.5±15.8(10)%,二龄草鱼种的成活率提高31.2±8.1(7)%,草鱼成鱼的成活率提高26.7±5.4(3)%。本文还对目前CFRV疫苗制作的成本和使用疫苗后带来成活率提高的经济效益作了分析,指出在生产上推广应用是可行的。