非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

试验旨在构建非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白（rEP153R）,并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列（GenBank登录号：FR682468.1）合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在16和37 ℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱－质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16 ℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱－质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

基于重组EP153R蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法的建立

为探究非洲猪瘟病毒(ASFV)EP153R蛋白的功能和建立ASFV抗体间接ELISA方法,本试验构建了EP153R蛋白杆状病毒表达系统,采用Western blot与IFA鉴定rEP153R蛋白的表达和免疫原性.结果显示,杆状病毒能高效表达rEP153R蛋白且可被小鼠多克隆抗体识别,具有良好的免疫原性.以此重组蛋白为抗...     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列(登录号:MG434500)设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380bp,可编码459个氨基酸,其中175-207bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 380bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

非洲猪瘟病毒A137R蛋白多克隆抗体的制备与应用

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高致病性病毒性传染病。为制备兔抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018分离株基因组DNA为模板扩增ASFV A137R基因,将其克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组表达质粒pET-21a-A137R,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,表达的A137R重组蛋白分子质量约15.0 ku,其主要以可溶形式表达。利用HisTrap亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得高纯度的A137R重组蛋白,利用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,经Protein G亲和层析介质纯化后经western blot、间接免疫荧光和免疫共沉淀试验检测结果显示,制备的兔抗ASFV A137R蛋白的多克隆抗体能特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的ASFV Flag-A137R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV A137R蛋白。本研究为进一步探究ASFV A137R蛋白的功能、其在ASFV感染及致病性中的作用和诊断技术研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列（登录号：NC_001659.2）设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1：128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。     

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列(登录号:NC_001659.2)设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。     

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1...     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

[目的] 获得抗原性好的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。[方法] 根据GenBank ASFV参考序列（登录号：NC_044959.2）合成360-12L基因,并插入pET-28a（+）载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。[结果] 成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37 ℃ 6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1：512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。[结论] 原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。     

非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用

非洲猪瘟病毒(ASFV) B318L是ASFV编码的晚期蛋白，具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用，本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L，经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3)经IPTG诱导并克隆至p GEX-6p-1载体中，采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达，采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性，采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示，在约60 ku处出现特异性条带，且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达；纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带，经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/m L。将纯化的r B318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血，采用western blot鉴定该多克隆抗体(pAb)，经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果，采用间接ELISA检测p Ab的效价。结果显示，制备的...     

双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号：XM＿010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64 000,能...     

非洲猪瘟病毒D250R蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】分析非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus,ASFV） D250R蛋白潜在的生物学功能,制备其多克隆抗体,为ASFV D250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等。通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白,Western blotting检测纯化蛋白的反应原性,将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析结果显示,D250R蛋白共由250个氨基酸组成,理论分子质量为29 822.54 u,理论等电点为8.96,为亲水性蛋白,无信号肽及跨膜区。修饰位点预测结果显示,D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点,其中丝氨酸（Ser）6个、酪氨酸（Tyr）6个、苏氨酸（Thr）3个;2个N-糖基化修饰位点,分别位于第61和197位氨基酸处。生物学功能预测结果显示,D250R蛋白含有Nudix序列,具有解水解酶活性。蛋白结构预测结果显示,D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20%、7.60%、15.20%和28.00%,三维空间结构存在较多α-螺旋,与二级结构预测结果基本一致。将ASFV D250R基因克隆至pET-32a （＋）获得pET-32a-D250R重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下,D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达,蛋白大小约44 ku,蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白;Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA检测结果显示,D250R蛋白抗体效价达到1：256 000,成功制备多克隆抗体;IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究在分子层面分析了D250R蛋白的理化性质及蛋白结构,在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达,纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性,为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP204L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克表达载体,构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用纯化后的P30重组蛋白作为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化,检验该方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达,在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16℃诱导12 h时蛋白表达量最高,不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示,P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。建...     

双峰驼IgA基因的原核表达及抗体制备

为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1∶32 000,Western blot鉴定抗体能特异性识别原核表达的pET-28a-IgA-H蛋白,并能有效地将双峰驼IgA与IgG区别开来,表明成功获得了双峰驼IgA重链恒定区的重组蛋白及特异性良好的多克隆抗体。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒pS273R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV） pS273R蛋白,并制备其多克隆抗体,为ASFV pS273R的功能研究提供材料。试验通过大肠杆菌表达系统表达重组pS273R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组pS273R蛋白并免疫BALB/c小鼠制备血清,经Protein G琼脂糖树脂纯化鼠抗pS273R蛋白多克隆抗体,通过Western blotting、间接免疫荧光（IFA）和免疫沉淀试验（IP）分析多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示,在16 ℃、1 mmol/L IPTG诱导条件下,pS273R蛋白以可溶形式高效表达,经纯化并免疫小鼠后,通过Protein G可以纯化出高质量的鼠抗pS273R的多克隆抗体。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting、IFA和IP检测到HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-pS273R蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞（PAMs）中的pS273R蛋白。本研究在大肠杆菌中实现了ASFV pS273R蛋白的高效表达,制备并纯化的抗pS273R多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,这为深入探讨ASFV pS273R蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。