鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p~(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P~(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.     

罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌,结合PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。致病性试验结果显示,该分离菌株具有较高的致病性,能引起罗非鱼发病、死亡,其病理变化与荧光假单胞菌引起的鱼类赤皮病完全相似。药敏试验结果显示,该分离菌株对氟哌酸、氧氟沙星、新霉素高度敏感,但对氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林等不敏感。     

荧光假单胞菌7-14flhA基因的克隆与功能的初步分析

为了探索flhA基因在荧光假单胞菌7-14(Pf7-14)鞭毛合成的作用,以铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的鞭毛蛋白FlhA(NC_008463.1)为诱饵,在荧光假单胞菌Pf-5(NC_004129)、Pf0-1(NC_007492)和SBW25(NC_012660)的伞基因组中进行BLASTP比对分析,结果在Pf-5、Pf0-1和SBW25的全基因组搜索到flhA的同系物,分别命名为flhAPf-5、flhAPf0-1,和flhASBW25.根据三者的核酸序列,设计简并引物flhA-F/flhA-R,以荧光假单胞菌7-14(Pf7-14)基凶组DNA为模板进行PCR扩增,并对得到的片段测序比对,发现该片段2 130 bp为一完整的开放阅读框,命名为flhAPf7-14.flhAPf7-14在氨基酸水平上与flhAPf-5和flhAPf0-1的同源性分别达到93%和94%.Southern杂交证明flhA 在Pf7-14基因组中为单一拷贝.通过同源重组单交换的方式构建了Pf7-14flhA基因插入失活突变株,结果表明flhA突变体缺失了鞭毛装置并丧失了游动性,而互补菌株则恢复了鞭毛合成能力和游动能力.本研究为今后进一步研究Pf7-14鞭毛合成、菌体游动性与该菌定殖能力及生防能力的关系奠定基础.     

铜绿假单胞菌F_(190—342)-I_(21—83)基因的克隆及其融合蛋白的原核表达

为了研究铜绿假单胞菌外膜蛋白F和I的重要表位,根据已公布的F和I基因序列设计2对特异性引物,以分离的水貂源铜绿假单胞菌ZHDL9基因组为模板,扩增重要的表位基因F_(190—342)(F1)和I_(21—83)(I2),并对得到的2段基因序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增所得F1和I2两段基因序列高度保守,不存在核苷酸的插入和缺失;通过融合PCR技术将得到的F1基因和I2基因无缝连接,得到651 bp的融合基因F1I2。将融合基因F1I2克隆至原核表达载体p ET-28a,成功构建了融合表达质粒p ET-28a-F1I2;将pET-28a-F1I2转化大肠杆菌BL21 (DE3),成功构建重组菌株BL21(pET-28a-F1I2),并对重组菌株进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测表明,成功表达了融合蛋白F1I2,且融合蛋白能够被His镍柱纯化; Western Blotting检测表明,表达的融合蛋白F1I2与铜绿假单胞菌ZHDL9菌株感染的水貂血清具有较好的反应原性。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因(LipA)在枯草芽孢杆菌pab02中的整合表达

对铜绿假单胞菌脂肪酶基因(Lip A)进行克隆,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并在枯草芽孢杆菌pab02中整合表达。根据铜绿假单胞菌Lip A基因设计引物,扩增Lip A基因,并进行测序,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,转化枯草芽孢杆菌pab02,并对转化后的阳性菌株进行诱导表达。结果显示,成功从铜绿假单胞菌A05菌株中扩增到长1 092 bp的Lip A基因,该基因与铜绿假单胞菌Lip A基因(登录号为AB290342)的同源性高达98%;该基因共编码311个氨基酸(aa),包含26个aa组成的信号肽和285个aa组成的成熟肽;成功构建了整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并将Lip A整合到枯草芽孢杆菌pab02染色体上,获得了重组枯草芽孢杆菌pab02–lip A;SDS–PAGE分析结果表明,脂肪酶蛋白得到了有效表达,该蛋白的相对分子质量约为37 000。     

缢蛏致病菌假单胞菌的分子生物学分析

从患病缢蛏（Sinvnovacula constricta）中分离到一株病原菌,命名为1#菌株。采用传统方法提取菌株DNA,PCR扩增其16SrDNA基因片段、测序,得到该菌基因片段序列长度为1438bp。用MegAlign软件进行比对5种不同种细菌基因序列,构建进化树。16SrDNA产物序列分析结果表明：该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与多株假单胞菌（Pseudomonas sp）的同源性为99％,在系统发育树上构成一个分支。在细菌系统发育分类学上,该菌株属于假单胞属,但与已定名的假单胞菌有一定的差异,与几种未定名的假单胞菌的亲缘关系最接近。对其分类地位的最后确定还需进一步的系统发育学分析。     

单核细胞增生李斯特菌SigB蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备单核细胞增生李斯特菌SigB蛋白及其多克隆抗体,采用PCR方法扩增参考菌株10403S的sigB基因片段,并克隆至原核表达载体pET-30a构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化SigB蛋白,通过免疫兔体获得多克隆抗体.结果表明:成功构建...     

德氏假单胞菌(Pseudomonas delafieldii)R-8脱硫基因启动子的克隆与鉴定

利用PCR方法,从专一性脱硫菌德氏假单胞菌(Pseudomonas delafieldii)R-8中克隆了脱硫基因启动子系列缩短的片段,连接至启动子探测型表达载体pPR9TT,电转原始菌R-8,并测定重组菌R-8-P中的报告基因LacZ表达量.结果表明脱硫基因核心启动子区缩短至300 bp,并对启动子序列进行了预测.     

耐铅微生物的筛选及其吸附性

为从重金属污染的土壤中筛选出耐铅微生物,为土壤重金属生物修复提供参考,用Pb~(2+)浓度梯度筛选培养法得到耐铅菌株,16S rRNA测序以及系统发育树初步鉴定菌株。在不同温度、盐浓度、pH梯度下研究耐铅菌株的耐受性。多个Pb~(2+)浓度探究菌株在不同Pb~(2+)浓度下的吸附性。结果表明,通过牛肉膏蛋白胨培养基培养,得到一株能够耐铅离子浓度在1 200 mg·L~(-1)的菌株。16S rRNA基因序列系统发育树显示,菌株P15属于大肠杆菌属(Escherichia)。该菌株在铅离子浓度为200 mg·L~(-1)下的去除铅离子能力最强,达到80%。经过测定菌株P15的各项生理指标表明,菌株适宜的环境条件分别为温度30℃,pH6,盐浓度0.005 mg·L~(-1)。该铅耐受性菌株P15在生物修复重金属污染的土壤上有较高的潜在应用价值。     

6-磷酸果糖激酶基因pfkA在施氏假单胞菌中的异源表达及其表型分析

糖代谢在生命活动中具有重要意义,它保证了生物体生命活动所需的物质和能量的供应。葡萄糖作为自然界中普遍存在的最简单的单糖,是生物体的理想碳源。施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501具有广泛的、典型的微生物代谢途径,但是该菌利用葡萄糖的效率很低。基因组分析表明A1501菌缺少糖酵解（EMP）途径中编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA,初步认为这可能是A1501菌不能高效利用葡萄糖的原因。利用穿梭质粒pLAFR3将大肠杆菌的pfkA基因导入到施氏假单胞菌中,通过pfkA基因的异源表达重建A1501菌的EMP途径。测定了重组菌株的糖类代谢能力,结果表明pfkA基因的导入并没有赋予重组施氏假单胞菌更强的葡萄糖及其他糖类的利用能力,说明A1501菌葡萄糖利用的低效率除了缺乏pfkA外,还有其他的因素。研究也发现,导入pfkA的重组施氏假单胞菌对H2O2高度敏感,推测pfkA导入重建后的EMP途径可能影响了该菌的还原力合成,导致菌体对氧化胁迫的耐受能力降低。     

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

 【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、 -278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体, 确定了启动子核心区域和主要的调控区域。     

登革病毒E蛋白基因表达载体的构建

利用高效表达载体pET系统，构建广东地区登革流行株E蛋白基因的高效表达载体，表达载体经酶切及测序鉴定表明载体构建正确。为探讨E蛋白在登革病毒致病机制中的作用。以及针对本地登革病毒高效、特异的单克隆抗体和高效价的特异高免血清的制备奠定了基础。     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建（摘要）（英文）

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PD-NR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选

【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪 Sall4 的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体pE2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中：包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪iPS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了pL2.1、 pL1.0和pL0.5等3个报告载体,检测结果发现,在pL2.1与pL1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异。载体pL1.0与pL0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多。另外,pL0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表明,猪Sall4启动子在-367 至-852 bp和-1 至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4启动子,证明Sall4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控 Sall4 表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用。     

Expression of Aminopeptidase N1 （APN1）, the Main Receptor Protein for Bacillus thuringiensis CrylA Toxin from Helicoverpa armigera Larval Midgut in Trichoplusia ni cells

The aim of this article is to successfully express the Bt （Bacillus thuringiensis） toxin receptor protein located on the internal membrane of larval midgut of cotton bollworm （Helicoverpa armigera Hübner） within eukaryotic expression system, which is one of the key links for clarifying the relationship between receptor and Bt resistance. The fragments of aminopeptidase N1 （APN1） gene without signal peptide in the susceptible and the resistant H. armigera were cloned separately using PCR method, and were separately cloned into pUC 19 vector. After sequencing the gene, the fragments encoding for APN1 without signal peptide were cloned into the Bac-to-Bac baculovirus expression system with transfer vector pFastBacHTB under the polyhedron gene promoter. The recombinant transposing plasmid pFastBacHTB/APN1 was screened and then transformed into Escherichia coli DH10Bac. It was cultured in LB medium, which contained Te, Kan, Ge, X-gal, and IPTG. The resulting recombinant bacmid was transfected into cells of the insect Trichoplusia ni and recombinant baculoviruse was obtained. The lysate of cells infected with recombinant baculoviruse was analyzed by SDS-PAGE and blot analysis. The results showed that the recombinant baculoviruse was fully capable of expressing APN1. The APN1 gene successfully expressed in T. ni cell established the base for continuing the research on its function and relationshio of resistance with Bt.     

杆状病毒介导RNAi抑制棉铃虫细胞色素P450 CYP9A14基因的转录

采用实时荧光定量PCR,测定棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)细胞色素P450 CYP9A14基因在氯氰菊酯抗性棉铃虫中肠里的表达量,结果表明抗性棉铃虫是敏感棉铃虫中肠表达量的17倍。将棉铃虫中肠P450 CYP9A14基因的一个490bp反向重复片段以双链RNA干扰(double-stranded RNA interference,dsRNAi)的方法重组到棉铃虫核型多角体病毒(helicoverpa nuclear polyhedrosis virus,HaNPV)中,结果表明以该重组病毒注射氯氰菊酯抗性棉铃虫体内后,幼虫中肠CYP9A14基因的转录水平显著下降。     

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。     

马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增，用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析，地高辛（ＤＩＧ）－探针原位杂交，ＤＮＡ序列预测，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。