卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。     

脱羰秋水仙碱诱导牛卵母细胞显核

用脱羰秋水仙碱(deme colcme,Deme)诱导牛卵母细胞显核.比较不同显核时间、Deme浓度以及极体形成等因素对牛卵母细胞显核的影响.结果显示:①0.5μg/mL Deme处理卵母细胞,诱导1 h时获得最高显核率(76.00%),高于0.5 h(61.18%)、1.5 h(64.10%)和2 h(63.46%)组;②不同浓度Deme处理成熟卵母细胞1 h,0.4和0.5μg/mL Deme组显核率较高,分别为75.24%和77.31%,显著高于0.3 μg/mL组(46.54%)与0.6 μg/mL(60.66%)组;③0.4 μg/mL Deme处理卵母细胞1 h,有极体组显核率(83.24%)与无极体组(77.54%)无显著性差异.研究表明,0.4 μg/mL Deme处理卵母细胞1 h能更好地诱导牛卵母细胞显核.     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞的体外成熟和早期孤雌发育的影响

本研究探讨了:(1)成熟培养基中葡萄糖和丙酮酸钠剂量对猪卵母细胞体外成熟极体排放率的影响;(2)培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸和亚牛磺酸的剂量对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响,同时探讨不同浓度乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在含不同剂量葡萄糖 丙酮酸钠的成熟液中体外成熟44~48 h,计算其极体排放率(试验1),进行化学法孤雌激活后,在含不同剂量的葡萄糖 谷氨酰胺 牛磺酸 亚牛磺酸与不同浓度的EDTA-N a的培养基中体外培养,计算孤雌激活胚的第48小时卵裂率和第168小时囊胚率(试验2)。结果表明:(1)葡萄糖 丙酮酸钠在1倍剂量(浓度分别为3.05 mm o l/L和0.91 mm o l/L)时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%,当其剂量加倍时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%;(2)随着EDTA-N a添加浓度的增加,猪孤雌激活胚的的囊胚发育率不断上升,添加浓度达到50μm o l/L时囊胚率最高(7.2±4.1)%,超过此浓度后囊胚率开始下降,培养基中添加适当浓度(25-100μm o l/L)的EDTA-N a对猪孤雌激活胚的囊胚发育率具有有利作用(P<0.05),添加浓度达到200μm o l/L时其有利作用消失;(3)培养基中葡萄糖 氨基酸的剂量过高(葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸的浓度分别大于5.55,1.0,7.0,5.0 mm o l/L)对猪孤雌激活胚的卵裂率无显著影响(P>0.05),但对其囊胚发育率有不利作用(P<0.05)。本研究得出以下结论:(1)适当浓度(25~100μm o l/L)的EDTA-N a对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)培养基中能量基质 氨基酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育。     

不同化学激活方法和电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响

本研究探讨了不同化学激活方法和不同电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在体外成熟培养44~48 h后,将核成熟卵母细胞分别用:(1)不同化学激活方法[①1 0%乙醇 1 0μg/mL放线菌酮;②2.5 mm o l/L氯化锶 1 0μg/mL放线菌酮;③5μm o l/L离子霉素 2.5 mm o l/L 6二-甲氨基嘌呤(6-DMAP);④200μm o l/L硫柳汞 8 mm o l/L二硫苏糖醇进行激活处理;⑤对照组——不用任何激活剂(试验1)];(2)用不同电场强度和脉冲时程进行电激活(试验2),之后放入胚胎培养液中进行体外培养7 d。研究结果显示:(1)4种不同化学激活方法处理卵子的1原核形成率、2原核形成率和原核形成率都显著比对照组的高(P<0.05),其中离子霉素 6-DMAP组的2原核形成率和总原核形成率最高,分别为(23.1±3.5)%和(65.2±3.5)%,显著比其他处理组的都高(P<0.0 5);(2)4种不同化学激活方法处理组的囊胚率都比对照组的高(P<0.0 1),其中离子霉素 6-DMAP组的卵裂率及囊胚率最高,分别为(4 6.6±1 8.5)%和(5.6±4.2)%;(3)本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4细-胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响;(4)电场强度为1.7 kV/cm、脉冲时程为50和70μs时猪体外成熟卵母细胞激活效果最好,卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数分别为:(77.4±9.7)%,(12.4±3.7)%,17.6±5.9和(75.1±10.6)%,(12.3±2.6)%,19.1±8.1。以上结果说明:(1)本研究所用的4种化学激活方法均能有效激活猪体外成熟卵母细胞,其中离子霉素 6-DMAP的激活效果最理想;(2)在本实验室条件下,采用1.7 kV/cm的电场强度、50~70μs的脉冲时程均能有效的激活猪体外成熟卵母细胞;(3)本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4细-胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响。     

应用Spindle-view观察哺乳动物成熟卵的纺缍体

应用Spindle—view对体外成熟培养20、22、24和26h的牛卵母细胞减数分裂纺锤体进行了观察；同时也对小鼠、家兔、山羊和猪等动物成熟卵母细胞的减数分裂纺缍体进行了观察。结果表明①在20-26h之间利用Spindle-view得到的牛卵纺锤体影像与极体的相对位置没有明显的变化；②纺锤体成像是否清晰可用于牛卵母细胞的质量监控；③Spindle—view适合于牛、家兔、小鼠和山羊成熟卵母细胞减数分裂纺缍体的观察。     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

本研究探讨了乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-N a的成熟培养液中体外成熟44~48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-N a的胚胎培养液中进行体外培养168 h。结果说明:(1)成熟液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(2)胚胎培养液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a,对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(3)成熟液和胚胎培养液中同时添加100μm o l/L EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(4)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTA-N a,对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响。     

SAHA对水牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育潜能的影响

卵母细胞体外成熟过程中组蛋白修饰发生了剧烈的变化,其表达模式的改变对卵母细胞的成熟乃至后续胚胎的发育有着至关重要的作用.去乙酰化酶抑制剂-伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)作为新型抗癌药物,是组蛋白去乙酰化酶的潜在抑制剂,在体内和体外抑制多种类型肿瘤细胞生长并促进其分化和凋亡.为探讨组蛋白去SAHA对水牛Bubalus bubalus)卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0,2,5,10,20和40 nmol/L)SAHA处理成熟期的水牛卵母细胞对其成熟率(第一极体排出率)、受精卵分裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的影响.结果表明,10 nmol/L SAHA处理组成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于对照组((77.07±1.79)％和(62.3士2.08)％,(86.81±1.93)％和(74.86±2.07)％,(27.56±2.86)％和(24.23±1.74)％,P＜0.05).随着浓度增加,各处理组囊胚总细胞数有提高的趋势,但组间差异不显著(141±10,151±13,165±17,170±14,147±20,185士22,P＞0.0S).qRT-PCR检测结果显示,SAHA对水牛卵母细胞成熟过程的处理,均显著下调了cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)结合蛋白基因CBP、组蛋白乙酰转移酶1基因(histone acetyltransferases 1,HAT1)、组蛋白去乙酰化酶1基因(histone deacetylase 1,HDAC1)在MⅡ期卵母细胞中的表达,P300则有所上调.实验结果表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理是一种能够提高水牛卵母细胞体外成熟效率促进胚胎发育的有效途径之一,该研究结果可为今后研究转基因克隆胚胎发育相关基因调控机理提供了理论基础.     

猪卵母细胞第1极体的分离与保存

通过对屠宰场废弃的猪卵巢卵母细胞进行体外成熟培养(IVM)获得成熟卵母细胞,对体外培养成熟卵母细胞第1极体(Pb1)排出、活性及其形态学进行了统计分析;分别采用酶消化和显微操作两种方法进行了Pb1分离与采集,继而进一步结合台盼蓝细胞染色法,探讨了不同温度保存条件下Pb1存活情况.结果表明:卵泡卵母细胞IVM 40 h后发现大量高活性Pb1;显微操作分离极体效果显著优于酶消化法,且分离的Pb1活力高,完整性好.39℃条件下大多数采集的Pb1存活时间仅有4h,4℃条件下保存40 h存活率可达85.0%;-20℃保存1周达95.0%,而超低温-196℃冷冻保存1个月存活率和形态正常率分别达89.1%和97.8%.     

水牛卵母细胞成熟时间对核移植效果的影响

主要探讨水牛卵母细胞的成熟时间对其体细胞核移植效果的影响,结果表明,在体外成熟(IVM16～24h)期间,不同的去核时间对水牛卵母细胞核移植后的融合率、分裂率和囊胚发育率都没有显著影响(P>0.05),但卵母细胞去核后的注核存活率,IVM16～18h组与IVM22～24h组有极显著差别(P<0.01)。经6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制成熟培养的卵母细胞,再成熟培养16～18h后,与直接在体外成熟培养16～18h的卵母细胞的融合率、分裂率和囊胚发育率相比,均无显著影响(P>0.05)。水牛卵母细胞的成熟时间对其核移植效果无明显影响,6-DMAP可用于调整水牛卵母细胞的去核操作时间。     

猪卵母细胞第一极体的分离与保存

本研究介绍了猪卵母细胞第一极体(PbΙ)的体外成熟培养、分离与回收及其保存方法,为进一步利用极体作为核供体重组猪卵母细胞研究提供了必要的参考依据。通过屠宰场废弃的猪卵巢卵母细胞的体外成熟培养（IVM）技术途径获得成熟卵母细胞，对体外培养成熟卵母细胞PbΙ排出、活性及其形态学进行了统计分析；分别采用酶消化和显微操作两种方法进行了PbΙ分离与采集，继而进一步结合台盼蓝细胞染色法，探讨了不同温度保存条件下PbΙ存活情况。结果表明：卵泡卵母细胞IVM 40h后发现大量高活性PbΙ；显微操作分离极体效果显著优于酶消化法，且分离的PbΙ活力高，完整性好。39℃条件下大多数采集的PbΙ存活时间仅有4 h，4℃条件下保存40小时存活率可达85.0%%；-20 ℃保存1 wk达95.0%，而超低温冷冻长期保存存活率和形态正常率分别达89.1%和97.8%。