亮甲酚蓝染色对水牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝（BCB）染色对水牛卵母细胞体外受精及孤雌激活胚胎发育的影响。[方法]卵丘卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟培养前用浓度26μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min,然后根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性（BCB＋,蓝色）和阴性组（BCB-,不着色）。以未经染色处理的COCs为对照组,控制对照组卵母细胞在含0.4%牛血清白蛋白（BSA）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中孵育90 min。体外成熟培养后统计各组的成熟率、体外受精和孤雌激活后的发育率。[结果]BCB＋组的成熟率（65.70%）显著高于对照组（59.86%）、控制对照组（58.42%）和BCB-组（48.86%）。在体外受精后的囊胚发育率方面,BCB＋组（27.08%）和对照组（25.49%）差异不显著,但显著高于控制对照组（20.50%）和BCB-组（8.45%）。在孤雌激活后的囊胚发育率方面,BCB-组显著低于其他各组,但BCB＋组、对照组以及控制对照组之间无显著差异。[结论]亮甲酚蓝染色筛选出的阳性卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但并不能显著提高卵母细胞体外受精及孤雌激活后的胚胎发育率。     

不同月龄广西富凤麻公鸡的繁殖性能比较

[目的]明确不同月龄广西富凤麻公鸡间的繁殖性能差异和相关性,为其种质资源保护提供更好的配种条件,同时为种鸡生产提供参考依据.[方法]以广西富凤麻公鸡为研究对象,从精液品质、睾丸发育状况及血清激素等角度系统研究不同月龄公鸡间的繁殖性能差异和相关性,并使用不同月龄公鸡的精液对母鸡进行人工授精,孵化第9 d照蛋并统计受精率.[结果]5、8和18月龄广西富凤麻公鸡的精液体积和精子密度无显著差异(P>0.05,下同),18月龄广西富凤麻公鸡的精子活力较5和8月龄公鸡的精子活力极显著降低(P<0.01,下同),在精子畸形率方面则表现为18月龄广西富凤麻公鸡较5和8月龄公鸡极显著升高.广西富凤麻公鸡在5~8月龄期间,随着月龄的增长公鸡睾丸的体积和重量均呈上升趋势,睾丸曲细精管直径呈增粗趋势,血清睾酮含量呈上升趋势;但在8~18月龄期间,整体上表现为随着月龄的增长公鸡睾丸的体积和重量呈下降趋势,睾丸曲细精管直径逐渐变细,且血清睾酮含量急剧下降.广西富凤麻公鸡各繁殖性能指标间的相关性分析发现,血清睾酮含量与两侧睾丸总重量、精液体积与精子活力呈中等强度正相关,精子畸形率与血清睾酮含量、精子活力与精子畸形率呈强负相关.不同月龄广西富凤麻公鸡精液的受精率无显著差异.[结论]广西富凤麻公鸡在5~8月龄期间其繁殖性能随着月龄的增长而提高,但在8~18月龄期间整体上表现为繁殖性能随月龄的增长而下降.即8月龄广西富凤麻公鸡睾丸发育状况最佳,生产上可适当提高8月龄公鸡的利用率.     

3种来源猪胚胎激活后6h内基因组DNA甲基化变化模式

主要探讨猪手工克隆(HMC)胚胎和体外受精(IVF)胚胎及孤雌激活(PA)早期胚胎发育过程中6 h内的单细胞核全基因组DNA甲基化模式.运用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光和激光共聚焦显微镜检测相对荧先强度的方法,检测猪手工克隆胚在融合后6 h内全基因组DNA甲基化模式,并与同时期猪体外受精胚及孤雌激活胚胎进行比较,从而探讨这3种胚胎变化模式的异同.结果显示:3种不同来源的胚胎在培养后不同时间点比较时,2、4、6 h均呈强甲基化状态,且均呈下降趋势;在同时间点比较时,2 h和6 h这两个时间点检测到3种胚胎的相对荧光强度均差异不显著(P＞0.05),而在4 h时,HMC胚胎显著高于PA和IVF胚(P＜0.05).结论:猪手工克隆胚在融合后6h内虽然也发生类似IVF胚的全基因组DNA去甲基化,但其去甲基化不充分,甲基化程度偏高,这可能是导致核移植胚胎核重编程不充分、发育能力低的一个原因.     

有无透明带猪卵母细胞电激活参数的优化及体外培养方式的建立

[目的]摸索无透明带猪体外成熟卵母细胞(ZFOs)电激活的条件和无透明带孤雌激活胚胎(ZFEs)的体外培养方式,为手工克隆法生产广西巴马小型猪体细胞核移植奠定基础。[方法]用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活ZIOs、ZFOs,用不同培养方式(微滴法和微穴法)培养ZIEs和ZFEs,检查第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数。[结果]有带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为125 V/(mm.80μs),微滴法培养的囊胚发育率为(30.54±11.06)%;无带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为85V/(mm.80μs),微穴法培养,其囊胚发育率为(12.77±6.98)%;单次脉冲的激活效果好于多次脉冲。[结论]对有无透明带胚胎的培养方式,微穴法培养无透明带胚胎,微滴法培养有带胚胎较合适,一次脉冲可以有效激活卵母细胞。     

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。     

水牛促卵泡素受体(FSHR)基因5''''端侧翼序列的克隆与分析

促卵泡素(FSH)是动物脑垂体分泌作用于卵巢卵泡生长、发育、分化、成熟和排卵的重要繁殖激素.由于是生物大分子,不能透过细胞膜,FSH必须与靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)结合,经过受体介导将信息传递到靶细胞内,才能发挥其生物学功能.目前国内外已对牛、山羊等多种动物的FSHR基因的Cdna序列进行了克隆测序,但是关于水牛FSHR基因5'端侧翼序列还未见报道.本研究对水牛FSHR基因5'端序列进行克隆和序列分析,其目的是寻找水牛FSH受体基因的SNP突变位点,从而为以后进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在水牛繁殖中的可能作用打下基础.     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）指位于曲精细管基膜上的一类原始精原细胞,近年来因其在生产转基因动物方面有广阔的应用前景,受到了极大的关注。在胚胎发育前期,一小部分细胞分化形成原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）,并迁移至生殖嵴,PGCs随后增殖分化形成生殖母细胞并迁移至睾丸基底膜,随着雄性动物出生,生殖母细胞迁移至细精管并转化成SSCs。本文概述了近年来SSCs的研究进展,主要包括SSCs的分离、鉴定、体外培养体系以及SSCs诱导精子。此外,本文重点阐述了SSCs的研究前景。     

猪精子和睾丸组织RNA的初步分析

试验采用Trizol一次法提取猪精子和睾丸组织的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中Protamine-1(PRM-1)、Protamine-2(PRM-2)、Clusterin、Heat shock protein 90(HSP90)、C-myc基因的mR-NA是否存在;通过不同精子数量的使用,检测在本试验条件下扩增出清晰PRM-1带所需要的适宜精子数量;通过琼脂糖电泳检测精子与睾丸组织RNA的电泳特征.结果,猪睾丸组织中有PRM-1、PRM-2、Clusterin、HSP90、C-myc的mRNA,而射出的猪精子(上游处理)本试验只检测出PRM-1的mRNA;在使用RNA沉淀剂时,3.0×107～6.5×107精子可得到清晰的PRM-1条带;本试验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖胶电泳图.初步研究的结果表明:射出猪精子中存在的RNA种类与睾丸组织中存在的RNA种类差异大;猪精子RNA的18S和28S片段与睾丸组织无明显差异.猪精子的RNA需要更多的研究.     

猪精子RNA提取的初步研究

实验采用Trizol一次法或试剂盒提取猪精子的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中鱼精蛋白(PRM-1)的mRNA;使用不同数量的精子,检测在本实验条件下能扩增出PRM-1带所需要的最小精子数量;通过OD260/280的测算,判断不同提取方法所得RNA的纯度;通过琼脂糖电泳得到精子RNA与睾丸、卵巢组织RNA的电泳图。实验结果表明:在使用RNA沉淀剂时,1.51×107精子可检测到PRM-1的mRNA,不使用沉淀剂则需要3.02×107精子才检测到;使用Trizol一次法提取的精子总RNA纯度较常规Mini试剂盒(W6221)高;本实验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖凝胶电泳图。初步研究的结果表明,Trizol一次法可用来提取精子总RNA供进一步研究;猪精子RNA的28S和18S片段与睾丸、卵巢组织无明显差异。     

流式细胞仪在猪性别控制中的应用初探

在国内首次报道使用流式细胞仪对猪进行性别控制研究。猪精液通过流式细胞仪进行X、Y精子分离,分离精子经过数小时保存后,用于陆川母猪输卵管授精,最后产出健康仔猪。试验结果表明:①第1次(2005-10-14)精子分离的纯度为:X88%、Y83%;活力为X35%、Y21%。第2次(2006-01-13)纯度为:X70%,Y68%;活力为:X52%,Y36%。②该试验中母猪受孕率为25%,未受孕者仍然可在生产条件下继续繁殖。③受孕母猪(1头)产出健康仔猪5头,出生成活率100%,大小均匀,活力良好,哺乳期(28 d断奶)平均日增重与生产群极为接近(151.43 g1、48.93 g),但产活仔数低(生产群为8.4头/窝)。④仔猪雌性率为60%。试验结果初步表明:在该实验室现有条件下,使用流式细胞仪分离的X、Y精子,母猪通过输卵管受精可以产出健康仔猪;精子分离对仔猪哺乳期生长无明显影响;对性别比例有一定调控作用。