猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

中华鼢鼠卵透明带3基因(mZP3)真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达

卵透明带3(zona pellucida 3,ZP3)蛋白是精卵结合最重要的受体。为了构建中华鼢鼠(Myospalax fontanierii)卵透明带3(mZP3)基因真核表达载体,本研究利用PCR方法得到加入酶切位点的mZP3片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,体外转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和尾静脉注射昆明小鼠(Mus musculus)体内,利用RT-PCR和Western bolt技术检测其表达情况。双酶切和基因测序鉴定结果表明,所构建的表达载体是pEGFP-mZP3;倒置显微镜观察到发绿色荧光的成功转染的细胞;RT-PCR和Western bolt检测结果表明,目的基因mZP3在CHO细胞中成功表达,并且小鼠肝脏内也检测到目的基因。研究结果表明,卵透明带3基因能够在CHO真核细胞内表达,为后期基因疫苗防治中华鼢鼠提供依据。     

黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达

通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL.     

菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力,在控制植物病害方面起着重要的作用.为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1),本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物,采用RT-PCR、3'-RACE及5+-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA序列(GenBank:GU361769,GU361770).tfchi1长为2 561 bp,具有6个内含子,长度分别为129、78、68、65、53和59 bp,包含1 194bp的ORF,编码一个由397个氨基酸组成的蛋白.推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96％,分子量为43.47kD,等电点为4.97.该蛋白无信号肽序列,有15个潜在的N-糖基化位点,Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构.tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115,酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物,重组蛋白的分子量与理论值相符.结果说明,本研究已从T.flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因.     

草酸青霉外切葡聚糖酶基因(cbh1)克隆及其在毕赤酵母中的表达和重组外切葡聚糖酶特性分析

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

棉铃虫精氨酸激酶(AK)的表达规律

精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是一种磷酸转移酶,参与无脊椎动物的细胞内能量代谢.为深入了解AK在棉铃虫(Helicoverpa armigera)细胞色素P450 (cytochrome P450) CYP6B6基因表达过程中起到的作用和调控机理,基于酵母单杂交结果采用RT-PCR从棉铃虫中肠cDNA扩增得到棉铃虫精氨酸激酶(HarmAK),构建大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株BL21:pET28a-HarmAK,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,pH-分光光度法检测HarmAK蛋白的催化活性,qRT-PCR检测棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中HarmAK基因的表达规律.研究结果表明,克隆得到HarmAK基因大小为1 068 bp,编码355个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别是39.8 kD和5.76.氨基酸序列分析表明,HarmAK蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HarmAK在大肠杆菌BL21中为可溶蛋白,Western blot和pH-分光光度法结果显示,融合蛋白His-HarmAK的大小与预期一致,且活性达到(5.5±0.85) μmol/(min· mg),表明HarmAK能磷酸化L-精氨酸.HarmAK在棉铃虫的所有发育阶段和6龄幼虫的所有组织中均有表达,1龄幼虫及6龄幼虫中肠的表达量最高.本研究将为利用HarmAK基因作为分子靶标来控制棉铃虫的研究奠定基础.     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建

巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

绒山羊成纤维细胞生长因子5基因(FGF5)毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞

绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5基因(fibroblast growth factor 5,FGF5)的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和c DNA为模板,利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS),并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体p EGFP-N1上,FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连,构建毛囊特异性表达载体p EGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后,对细胞表达产物进行q RT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明,载体p EGFP-N1-KF构建成功;q RT-PCR结果表明,FGF5正常表达;Western blot结果显示,P2A能够有效剪切FGF5和EGFP融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。本实验为进一步研究绒山羊FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。     

绵羊β2-肾上腺素能受体基因(β2-AR)的克隆及其第二细胞外环在大肠杆菌中的表达

本研究以β2-肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)基因的保守序列设计了1对PCR引物,通过PCR技术首次获得了萨福克、小尾寒羊和中国美利奴(新疆型)3个绵羊(Ovis aries)品种的β2-AR基因(GenBank登录号分别为EU707939、EU707940和EU707941),该基因含一个1 257 bp的开放阅读框(ORF),编码418个氨基酸残基.核苷酸序列分析显示,绵羊β2-AR基因与牛、猪、大鼠和人的相似性分别为98.4%、88.5%、84.2%和80.5%.通过基因合成技术合成了双拷贝的绵羊β2-AR第二细胞外环编码区DNA,并将其与pET32C(+)重组.重组菌以1 mmol/L IPTG诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,绵羊β2-AR第二细胞外环融合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,表达产物分子量约为26 kD,表达水平最高占菌体总蛋白的40.3%.     

鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断.     

牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病.丙酮酸脱氢酶复合体E1 (pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化.本研究参照GenBank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα (GenBank登录号:KU355295)及pdhβ基因(GernBank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR (Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ.表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E 1α亚基融合蛋白PDHA及PDHcE1β亚基蛋白PDHB.纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHcE1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究.结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白rPDHA及rPDHB的分子量分别约为40和37kD,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当.本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP3-GP5-M融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业发展的传染病,为了PRRSV GP3-GP5(N-糖基化蛋白)-M(膜蛋白)融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性,本研究利用脂质体法将构建好的真核重组表达质粒pcDNA3.1-ORF3-ORF5-ORF6转染猪肾细胞(PK-15细胞),经G418(600 μg/mL)筛选(72 h)获得稳定表达PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白的稳定细胞株.以RT-PCR分析目的基因转录;间接免疫荧光检测融合蛋白表达;Western blot和小鼠(Mus musculus)免疫试验检测融合蛋白免疫原性.结果表明,RT-PCR检测到3种目的基因的转录;间接免疫荧光检测到融合蛋白得以表达,Western blot检测到融合蛋白可与阳性猪血清发生特异性反应.小鼠免疫试验二免后S/P=样本/阳性对照的比率,达到1.80(S/P＞0.4为阳性),并且至少可以持续1个月.本研究成功实现了PRRSV GP3-GP5-M 融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达,证实PRRSV GP3-GP5-M融合蛋白具有良好的免疫原性,为PRRSV 多基因核酸疫苗研制提供了基础资料.     

无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达

为了实现人白血病抑制因子基因(hLIF)在奶山羊乳腺上皮细胞中的稳定表达,本实验利用条件重组元件LoxP序列、山羊β-酪蛋白5'和3'同源臂、正负向筛选标记基因和hLIF基因构建hLIF基因打靶载体。脂质体法转染奶山羊(capra hircus)乳腺上皮细胞,进行遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选获得同源重组的阳性克隆,并通过PCR、实时定量PCR和Western blot检测阳性克隆中hLIF基因的表达情况。酶切和测序分析结果显示,实验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。阳性克隆经PCR、实时定量PCR和Western blot均检测到了目的条带。表明打靶载体pLoxP-NT53L已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊生产提供了打靶载体。     

猪Resistin基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中，经酶切及测序鉴定后，采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞，用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1－RSTN，经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1－RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。     

犬白细胞介素-2 基因(IL-2 )的克隆与表达

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列，设计了1对引物。采用RT-PCR技术，以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料，从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550bp。分离纯化片段，克隆入pMD18-T载体，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致，生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，IPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳显示21．8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明：表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。