稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白并检测其生物学活性,本实验采用RT-PCR方法扩增血清12型BTV的VP5基因,构建重组质粒pMAL-VP5。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,融合了大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的VP5重组蛋白以可溶形式表达,分子质量约为112.2 ku。利用MBP标签对重组蛋白进行纯化,并以其作为包被抗原,间接ELISA检测山羊血清样品,结果 5份羊血清P/N值均大于1,其中有1只羊检测结果 P/N值为2.396,鉴定为阳性血清,表明重组蛋白可以与VP5抗体反应,可以作为检测BTV VP5抗体的抗原,为今后进一步开展BT诊断研究奠定了基础。     

玛纳斯河流域绿洲农区残余盐渍化土壤质量评价

土壤质量评价对于评估土壤的现状与生产力、促进农业可持续发展、保护生态环境具有重大意义。通过分析玛纳斯河流域绿洲下属的7个灌区内盐渍化土壤理化性质,采用主成分分析法对玛纳斯河流域绿洲农区残余盐渍化土壤质量进行评价。结果表明:(1)影响玛纳斯河流域绿洲农区土壤质量的最小数据集包括土壤总盐、有机质、pH值、Na+、Mg2+、碱解氮和土壤质地;(2)绿洲农区土壤养分丰富度依次为:速效钾、有效磷、碱解氮、有机质;(3)绿洲农区土壤质量以Ⅱ级[0.65<土壤质量综合评价指数(IFI)≤0.85]、Ⅲ级(0.45相似文献   

表达水疱性口炎病毒G基因重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究

水疱性口炎是由水疱性口炎病毒(VSV)引起的人兽共患性传染病,在我国尚无可用疫苗。为研制安全有效的水疱性口炎疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统为基础,构建并拯救出表达VSV糖蛋白(GP)的重组病毒(rLa-VSV-G)。间接免疫荧光、激光共聚焦、western blot等试验证明VSV-GP在重组病毒中正确表达;体外致病试验结果表明,rLa-VSV-G保持了LaSota亲本株的低致病性和高滴度的鸡胚生长特性;rLa-VSV-G接种4周龄~5周龄BALB/c雌性小鼠后,可以诱导显著的VSV中和抗体反应。本研究表明,重组病毒rLa-VSV-G具有作为防控VSV储备性疫苗的潜力。     

佛山市顺德区妊娠糖尿病孕妇胎儿生长受限的危险因素

目的 分析佛山市顺德区妊娠糖尿病(GDM)孕妇胎儿生长受限(FGR)的危险因素.方法 2484例GDM按照是否发生FGR分为FGR组(n=136)和非FGR组(n=2348),分析FGR危险因素.结果 GDM孕妇中共有136例FGR(5.79％).FGR组中双胎妊娠、妊娠高血压、胚胎移植、羊水过少GDM孕妇高于非FGR...     

IS711和omp2作为布氏杆菌种属及种株间分子鉴别诊断标记的研究

布氏杆菌为世界性具重要公共卫生意义的人兽共患疫病原，分6个种。建立种间及种株间安全敏感、经济有效的快速鉴别诊断方法对布病防制及分子流行病学研究具有重要意义。布氏杆菌IS711和omp2基因具有种属特异性，可用于布氏杆菌的PCR分子诊断。其中IS711为转座因子，在不同种布菌种存在插入位置的多态性，外膜蛋白OMP2编码基因则存在反向重复序列及种株间的多态性。为此，分别采用复式-PCR、PCR和限制性酶切片段长多态性（RFLP）分析，对分属于B．mclitcnsis、B．suis和B．abortus的不同种布氏杆菌的不同种株，M5、M16、S2、S6和S19进行分子鉴别诊断。结果显示，根据IS711基因特定PCR扩增片段长多态性，可进行布氏杆菌种间的快速鉴别；而omp2编码基因PCR扩增片段PsrⅠ、KpnⅠ、NcoⅠ和Eco47 Ⅲ等4种限制酶片段长多态性，则可成为布氏杆菌菌株间特异的分子鉴别诊断标记，甚至疫苗株M5和野毒株M16之间的分子诊断标记。     

跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤.2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化.本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4 (TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能.本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据.     

牛γ干扰素单克隆抗体的制备与抗原捕获ELISA检测方法的建立

为了建立一种简便、快速、可靠和经济的牛γ干扰素(BOIFN-γ)的免疫学检测方法,本研究通过杂交瘤技术建立了2株抗rBoIFN-γ单克隆抗体(MAb)2G6和5F9.Western blot、抗病毒活性阻断实验表明2株MAb与rBoIFN-γ有高亲和活性.相加EUSA表明2G6和5F9识别rBoIFN-γ不同的抗原表位.利用2G6作为捕获抗体,5F9-HEP作为检测抗体建立的抗原捕获ELlSA方法可特异性的检测不同系统表达的rBoIFN-γ,而且与rBoIFN-a、rBoIFN-β不发生交叉反应.该方法的建立为抗原捕获ELISA定量检测BoIFN-γ试剂盒的研制奠定了基础.     

鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断.     

用于山羊痘病毒载体的强痘病毒启动子筛选

为提高重组山羊痘病毒(GPV)中外源基因的表达水平及筛选强转录效力的启动子,本研究选择桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子(42K)、痘病毒合成晚期441启动子(SL441)、痘病毒合成晚期454启动子(SL454)、牛痘病毒(VV)早晚期P7.5启动子(P7.5)、VV晚期P11启动子(P11)、VV H6启动子(H6)、VV合成早晚期启动子(E/L)及人工优化早晚期启动子(LEO)8种启动子,并在其下游插入萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因,分别构建了启动子效力检测重组质粒。并分别将其转染于预感染GPV的DF-1(鸡)、LT(绵羊)、BHK-21(仓鼠)和Vero(猴)4种动物源细胞中,以表达海肾荧光素酶(Rluc)的p RL-TK为内参质粒,24 h后检测荧光素酶活性。结果表明,在LT细胞中,SL441转录效力最强;在DF-1细胞中,LEO转录效力最强,为其他启动子的1.19~14.46倍;在Vero细胞中,H6和SL441的转录效力较强,达到其他启动子的1.21~11.24倍;在BHK-21中,H6启动子的转录效力也显著强于其它启动子。本实验最终确定了GPV在4种动物源细胞中转录效力强的启动子,该研究结果为进一步提高以GPV为载体疫苗的免疫效力奠定了基础。