小鼠精子体外培养过程中Ca~(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。     

杜洛克猪精子体外4℃保存过程中活力参数及蛋白修饰变化

为探究体外4℃保存对猪精子活力参数及蛋白修饰的影响,使用猪精液保存稀释液体外4℃保存猪精子7d,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)分析测定新鲜精液和保存7d后精液的精子活力指标;使用相应试剂盒检测精子中ATP水平及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性;应用蛋白免疫印迹(WB)技术,比较新鲜精液在4℃保存7d后蛋白翻译后修饰水平的变化。结果表明,猪精液体外4℃保存7d后,精子活力参数呈现下降趋势。其中,运动力(MOT)、快速前进性运动速率(PRO)、平均路径速度(VAP)、平均直线运动速率(VSL)与新鲜精液相比分别降低59.99%、37.03%、12.34%、18.97%,且差异显著(P0.05);发现精子中ATP水平和GAPDH酶活性在4℃保存7d后显著降低(P0.05),即随着体外保存时间的延长,精子细胞内的能量供应不足,代谢水平降低;猪精液4℃保存7d后精子蛋白的磷酸化和酰化修饰明显减弱,这一结果与精子活力、代谢酶活性结果的变化趋势一致。研究结果证实,在体外4℃保存条件下,可能因精子细胞内能量代谢受阻而影响了精子活力及蛋白修饰水平。因此,本研究无论对于丰富精子的能量代谢基础理论,还是对于延长猪精液低温保存时间,提高人工授精效率,均具有重要的理论和实践意义。     

重金属铬对体外培养猪精子活力及蛋白磷酸化水平的影响

为探究铬元素在猪精子体外获能培养过程中,对猪精子活力、蛋白磷酸化信号通路的影响,研究采取八头杜洛克猪新鲜精液,分别在体外获能培养液中添加不同浓度的6价铬离子(0、0.1、0.5、1、2、10、100μmol/mL)以及双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、异丁基黄嘌呤(IBMX)、PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKAs信号通路调节因子进行调控培养2h。利用精子活力计算机检测(CASA)、蛋白质免疫印迹(WB)技术,分析测定猪精子体外铬暴露获能培养过程中精子活力、蛋白磷酸化水平,并用相应试剂盒检测细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性、腺苷-3′,5′-环化一磷酸(cAMP)及ATP水平。结果表明:铬离子对猪精子活力、蛋白磷酸化水平有抑制作用,且随铬离子浓度增加抑制作用增强。当铬浓度达到2μmol/mL时精子活力MOT(58.4%)显著低于获能培养组(73.6%)(P0.05);10μmol/mL铬处理明显抑制蛋白磷酸化水平,且细胞内GAPDH活性、cAMP及ATP水平显著降低(P0.05)。而10μmol/mL铬处理中分别添加葡萄糖(5.0μmol/mL)及dbcAMP(1.0 mmol/L)和IBMX(0.1 mmol/L),能缓解铬对蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化(P-PKAs)及GAPDH活性的抑制作用。结果提示铬可能是通过干扰糖代谢及cAMP/PKA信号通路影响猪精子活力及蛋白磷酸化水平。本研究首次探究了体外培养过程中铬离子对家畜精子活力的影响,并初步探究了其作用机理,为进一步研究铬离子引起繁殖毒性的分子机制及家畜繁育提供一定的理论基础。     

NAC抑制镉离子诱导的小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化作用

重金属镉是环境中广泛存在的污染物,对机体生殖系统有很强的毒性作用。镉能诱导精子细胞蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)发生酪氨酸磷酸化修饰,但机制尚不清楚。本研究利用蛋白免疫印迹技术探讨镉离子对小鼠生殖系统的毒性作用、镉诱导生殖细胞蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰的机理及抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对精子的保护作用。结果表明,镉离子能减弱生殖细胞的能量代谢水平,从而抑制睾丸的生长发育并导致产仔数下降;镉离子能特异性诱导精子DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰,且与钙离子具有协同作用。此外,NAC可在体外有效抑制DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化从而抑制镉的生殖毒性,并恢复精子能量水平和活力参数。本研究从NAC抑制镉离子诱导特异性蛋白磷酸化修饰的角度,揭示NAC保护作用机制,旨在为镉离子生殖毒理学研究及疾病防治提供理论基础。     

钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响

研究主要探究钙离子(Ca2+)对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力的作用。利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)检测、蛋白免疫印迹测定不同Ca2+浓度对精子活力指标及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,并对精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白的分布情况进行观察。结果显示,当Ca2+浓度≤1.0mmol/L时,精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平增高;然而,当Ca2+浓度≥3.0mmol/L时,则明显抑制精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平,尤其分子量约为27和34kDa的高丰度蛋白磷酸化程度明显降低(P0.05)。高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化。因此,细胞外钙离子对猪精子活力和蛋白磷酸化起到重要调节作用,低浓度Ca2+促进精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化,高浓度Ca2+(≥3.0mmol/L)抑制精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化。本研究初步明确了Ca2+浓度对猪精子蛋白磷酸化及精子活力的影响,为进一步研究精子获能提供参考。     

睾丸支持细胞对体外精子活力的影响

通过建立小鼠睾丸支持细胞与精子共培养的方法,达到体外提高精子活力的目的.利用睾丸组织切片技术,观察并分析支持细胞对生精细胞的作用.从6~7日龄小鼠睾丸中分离睾丸支持细胞,体外培养两天后,形成细胞单层作为滋养层.取小鼠附睾尾内精子,转移到以支持细胞为滋养层的培养液中培养,同时设立对照组.通过精子分析仪观察各组精子的活力,结果显示,以支持细胞为滋养层的精子前向运动百分比为56.1±5.81%,显著高于对照组40.7±2.96% (P<0.05).利用激光共聚焦显微镜观察精子结构,结果显示两组精子形态结构差异不显著,表明支持细胞能够提高体外精子的活力,但不改变精子的形态结构.     

猪精子获能期间蛋白质磷酸化时间依赖性的上调

通过获能猪精子酪氨酸磷酸化蛋白分离和表达,来确定精子获能的最佳状态.将猪精子悬浮于改良的Tris缓冲液(mTBM)获能培养基中,在体积分数为5% CO2孵箱37 ℃培养,以考马斯亮蓝染液染色的方法来评价精子获能状态, 经过SDS-PAGE分离后,进行Western免疫印迹分析,检测获能猪精子间酪氨酸磷酸化蛋白的分布.有27,47 ku的2种蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中27 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势,而 47 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养1.5 h时最高,后呈递减趋势,1.5 h时获能状态最佳.     

琥珀酰化修饰对甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的影响

通过定点突变和生物学分析,研究了赖氨酸琥珀酰化对GAPDH活性的影响。结果表明：发菜GAPDH基因全长为1 014 bp,由338个氨基酸组成,其中K264位点在藻类中高度保守。将K264位点的氨基酸K(AAA)突变为R(AGA),野生型和突变型GAPDH在大肠杆菌中表达,获得一个36.61 ku的外源蛋白。纯化后蛋白活性测定发现,发生琥珀酰化修饰比未发生琥珀酰化修饰的GAPDH(K264)活性显著降低,表明琥珀酰化修饰参与发菜GAPDH活性的调节。研究结果为深入研究发菜GAPDH的分子信息和生物学功能提供理论参考。     

高、低温催青诱导家蚕滞育发生中的蛋白质修饰

【目的】研究高、低温诱导家蚕Bombyx mori滞育发生时蚕卵蛋白质修饰的差异,为后续深入探究昆虫滞育诱导的分子机制提供参考。【方法】饲养二化性家蚕品种,筛选出稳定的受高、低温诱导滞育发生的家蚕品系。以此为材料,分别于25和15℃孵化蚕卵,敏感期和点青期取样进行表观遗传学研究,通过SDS-PAGE电泳和Western blot检测蛋白修饰的差异。【结果】高温(25℃)组蚕卵蛋白的甲基化修饰水平始终高于低温(15℃)组,点青期有显著差异;高、低温处理组之间的乙酰化修饰水平一直差异显著,在点青期高温组显著低于低温组;低温组的泛素化修饰水平始终高于高温组,尤其是发育前期;磷酸化修饰水平整体较高,但高、低温处理组之间差异不显著;丙二酰化在高、低温处理组之间没有明显差异;琥珀酰化的修饰水平始终较低,在发育后期有明显的差异修饰蛋白出现。【结论】蚕卵在25℃催青过程中蛋白质泛素化和乙酰化修饰水平与15℃低温组在全时期都存在显著差异,甲基化修饰水平在点青期存在显著差异,表明甲基化、泛素化和乙酰化修饰在家蚕早期滞育诱导过程中起作用。     

大鳞大马哈鱼精子活力的观察

采集成熟的大鳞大马哈鱼精子,在不同的激活介质、人工精浆(ASP)、pH和温度条件下进行活力观察。结果表明:用生理盐水(BSS)激活的精子活力高于用水激活(P<0.05),单尾鱼的精子活力高于多尾混精(P<0.05);在ASP A,B和C液中,用ASP C液保存精子的效果最好(P<0.05);保持大鳞大马哈鱼精子活力较强的适宜pH值为8.19-8.40,而活力最强时pH值为8.40;在4℃下保存的大鳞大马哈鱼精子活力最高;大鳞大马哈鱼受精率最高时的温度和pH值分别为4℃和8.40,这与大鳞大马哈鱼精子活力最强时的温度和pH条件高度相关。     

稀释液中添加不同浓度的维生素B12对牛细管冷冻精液精子形态的影响

为了阐明维生素B12（VB12）对牛细管冷冻精液形态的影响，在常规稀释液中分别添加0．00％、0．25％、0．50％、0．75％、1．00％的VB12进行试验，比较观察结果表明：0．50％组顶体完整率高于对照组，差异极显著（P〈0．01），0．75％组高于对照组差异显著（P〈0．05），1．00％组低于对照组，差异不显著（P〉0．05）。0．50％组的精子畸形率低于对照组，差异显著0．05），1．00％组高于对照组，差异不显著（P〉0．05）。显著（P〉0．05）。（P〈0．05），0．75％组低于对照组，差异不显著（P≥0．25％组的顶体完整率、畸形率与对照组相似，差异不     

实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响

【目的】探索实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【方法】采用实时精子分离系统对精液进行分离优选,液氮冷冻法制作细管冻精,以未分离精液为对照,检测实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【结果】分离优选精子解冻后,精子活率、顶体完整率、质膜完整率、正常染色质率均明显高于对照组(P<0.01);分离组精子的正常形态率也显著高于对照组,且未受冷冻-解冻过程的影响(P>0.01);分离过程对精子密度也未产生显著影响(P>0.01)。【结论】实时精子分离系统可以显著改善猪冷冻精液的品质。     

蜜蜂一雌多雄交配的研究进展

 一雌多雄交配体制是较为少见的交配体制,至今人们只对极少数一雌多雄制的鸟类进行过详尽的研究。该文从3种学说的研究进展和交配顺序的研究进展两方面对蜜蜂一雌多雄交配现象作了阐释,以期为相关的研究提供有益的帮助。     

不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨体外受精时不同精子浓度对精子穿入成熟卵母细胞及后续发育的影响。[方法]以冷冻-解冻精子为材料,以1×106、1×107个/ml 2种精子浓度进行体外受精,研究不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响。[结果]当精子浓度为1×106、1×107个/ml时,精子穿入率分别为83.18%、88.23%,单精入卵率分别为40.55%、9.02%,多精入卵率分别为59.45%、90.98%,平均每个卵母细胞中的精子数分别为2.03、3.26个,雄原核形成率分别为84.10%、86.40%,单精入卵率、多精入卵率有显著差异(P<0.05),其他指标无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为应用冷冻-解冻精子建立猪卵母细胞的体外生产系统提供了依据。     

短尾鮠精子细胞和精子的超微结构研究

用透射电镜观察了短尾鮠精子细胞和精子的形态以及细胞核、拟染色体和线粒体等的结构变化规律。结果表明,随着精子细胞的发育,核质凝聚程度逐渐增强。精子细胞时期细胞器较丰富,到精子细胞后期,细胞器的形态和数量发生了较大变化。短尾鮠的精子具有椭圆的头部和复杂的中片;近侧中心粒和远侧中心粒靠近核的中央;鞭毛呈9+2轴丝结构,并具有由外膜折迭形成的波浪形的鳍状结构。     

乳牛精子细胞核可被精确地分成类似于X,Y精子的两个群体

由于哺乳动物雄性配子(精子)有性染色体的差异,使哺乳动物X、Y精子在质量或密度上存在着微小的差别。因此,长期以来人们试图将两性精子分开,以人的意志控制动物性别,按人类的需要进行畜牧业生产。但是由于精于之间发育上的差异所引起的质量差掩盖了染色质的微弱差异,从而难以达到理想的分离效果。本实验先将两性精子共有的顶体和尾部去掉,以突出X、Y染色质的质量差异,再将精子细胞核在氯化铯密度梯度离心下分成两个核群区带。该实验为X、Y精于分离效果的鉴定提供了一种有效的方法。     

淮河鲤鱼的精子在银鲫雌核发育子代中的生物学效应

研究结果表明,异源精子不仅能够刺激银鲫卵雌核发育,而且还影响银鲫雌核发育子代某些性状。如对于子代的生长,性比,体色和肝脏ＬＤＨ酶产生影响。淮河鲤鱼可以代替兴国红鲤为父本繁殖异育银鲫。     

细鳞斜颌鲴精子活力观察

为了解细鳞斜颌鲴精子的生理特性,采用实验生态-显微观察方法研究了几种因子对细鳞斜颌鲴精子活力的影响.结果表明,精子能激活的pH范围为5.0～10.58,精子活力较好的pH范围为6.0～7.84;pH 6.9时精子激活率达（89.00±1.0）％、运动时间达25.00±2.65 s、寿命达30.67±2.08 s.精子在1.0～7.0 g/L葡萄糖溶液中均有一定比例被激活,在6.0 g/L葡萄糖浓液中激活率达（89.33±0.94）％、运动时间达25.67±1.25 s、寿命达33.67±0.94 s.精子在2～7 g/L NaCl及KCl溶液中均能激活,在5 g/L NaCl及KC1溶液中活力较好;精子在0.2～0.5 g/L MgCl2及CaCl2溶液中激活率较低,在0.1、0.6、0.7 g/L MgCl2及CaCl2溶液中出现凝集现象.精子在低温4℃下保存3h活力与鲜精基本相同.D-19和Saad稀释液能有效抑制精子运动,且重新被淡水激活后活力较好,可考虑作为精子冷冻保存用稀释液.     

热应激对小鼠精子发生及其性能的影响

摘要 取24只小鼠分为慢性热应激组(EGⅠ)、急性热应激组(EGⅡ)和空白对照组(CG)。EGⅠ组每天早上移入40℃(相对湿度为53％～56％)的热应激箱内热应激10min,连续9d,到第10d,EGⅠ和EGⅡ同上热应激15min。结果显示:在热环境下,EGⅠ、EGⅡ组动物的肛温均比CG组高,EGⅡ组又比EGⅠ组高;3组动物睾丸重量及指数无明显变化;EGⅠ、EGⅡ两组动物精子数量及活动率均比CG组明显低(P<0.01);畸形率比CG组均高,EGⅠ组的精子数量、活动率显著低于EGⅡ组,畸形率极显著地高于EGⅡ组(P<0.01);在畸形的精子中,CG组主要以头部缺失为主,而EGⅠ组却以尾部缺失为主,EGⅡ组头部、尾部缺失相近。结果表明:热应激对精子的发生过程有毒性作用,抑制精子的形成,降低精子的数量及活动性能。     

鸡精液稀释液筛选试验

本试验观察了13种稀释液在低温(3～5℃)和室温(15～25℃)下保存鸡精液的效果。根据预定标准,结果以谷氨酸钠的普通制剂——食用味精为主要成分的6号液、9—B液和9—C液被选为优等液。6号液在低温下精子生存指数为15.02±2.44(x±s),显著高于对照液的11.09±3.92(P<0.05)。9—B液和9—C液在低温下精子存活时间分别为35.5±6.38小时,34.4 3±7.78小时,显著高于对照液的27.07±7.89小时(P<0.05)。另外,4、5和7号液被选为良等液,其保存效果达到了对照液的水平(P>0.05)。