钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响

研究主要探究钙离子(Ca2+)对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力的作用。利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)检测、蛋白免疫印迹测定不同Ca2+浓度对精子活力指标及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,并对精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白的分布情况进行观察。结果显示,当Ca2+浓度≤1.0mmol/L时,精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平增高;然而,当Ca2+浓度≥3.0mmol/L时,则明显抑制精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平,尤其分子量约为27和34kDa的高丰度蛋白磷酸化程度明显降低(P0.05)。高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化。因此,细胞外钙离子对猪精子活力和蛋白磷酸化起到重要调节作用,低浓度Ca2+促进精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化,高浓度Ca2+(≥3.0mmol/L)抑制精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化。本研究初步明确了Ca2+浓度对猪精子蛋白磷酸化及精子活力的影响,为进一步研究精子获能提供参考。     

不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响

为探讨不同获能方法对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,冻融塔里木马鹿精子随机分为4组,用钙离子载体、肝素、咖啡因和 Percool 离心4种方法进行精子获能的诱导,利用金霉素（CTC）染色法评价精子获能状态,采用 SDS-PAGE 分离精子膜蛋白,进行 Western blotting 免疫印迹分析,检测酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平.结果显示,冻融精子经4种精子获能方法处理后,肝素诱发的精子获能率显著高于钙离子载体组和 Percool 组（P ＜0．05）.钙离子载体组、肝素组和咖啡因组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平高于 Percool 组和对照组.另外,冻融精子随着上游处理及肝素诱导获能的进行,检测到分子量分别为14,25~30,40,47,55 ku 的酪氨酸磷酸化蛋白,这些蛋白的酪氨酸磷酸化水平在获能60~120 min 期间相对较高,而且此时精子获能率及超激活运动精子比例也显著提高（P ＜0．05）.结果提示,肝素可以较好的诱导马鹿精子获能,马鹿精子获能与蛋白酪氨酸磷酸化相关.     

重金属铬对体外培养猪精子活力及蛋白磷酸化水平的影响

为探究铬元素在猪精子体外获能培养过程中,对猪精子活力、蛋白磷酸化信号通路的影响,研究采取八头杜洛克猪新鲜精液,分别在体外获能培养液中添加不同浓度的6价铬离子(0、0.1、0.5、1、2、10、100μmol/mL)以及双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、异丁基黄嘌呤(IBMX)、PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKAs信号通路调节因子进行调控培养2h。利用精子活力计算机检测(CASA)、蛋白质免疫印迹(WB)技术,分析测定猪精子体外铬暴露获能培养过程中精子活力、蛋白磷酸化水平,并用相应试剂盒检测细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性、腺苷-3′,5′-环化一磷酸(cAMP)及ATP水平。结果表明:铬离子对猪精子活力、蛋白磷酸化水平有抑制作用,且随铬离子浓度增加抑制作用增强。当铬浓度达到2μmol/mL时精子活力MOT(58.4%)显著低于获能培养组(73.6%)(P0.05);10μmol/mL铬处理明显抑制蛋白磷酸化水平,且细胞内GAPDH活性、cAMP及ATP水平显著降低(P0.05)。而10μmol/mL铬处理中分别添加葡萄糖(5.0μmol/mL)及dbcAMP(1.0 mmol/L)和IBMX(0.1 mmol/L),能缓解铬对蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化(P-PKAs)及GAPDH活性的抑制作用。结果提示铬可能是通过干扰糖代谢及cAMP/PKA信号通路影响猪精子活力及蛋白磷酸化水平。本研究首次探究了体外培养过程中铬离子对家畜精子活力的影响,并初步探究了其作用机理,为进一步研究铬离子引起繁殖毒性的分子机制及家畜繁育提供一定的理论基础。     

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

猪精子获能期间蛋白质磷酸化时间依赖性的上调

通过获能猪精子酪氨酸磷酸化蛋白分离和表达,来确定精子获能的最佳状态.将猪精子悬浮于改良的Tris缓冲液(mTBM)获能培养基中,在体积分数为5% CO2孵箱37 ℃培养,以考马斯亮蓝染液染色的方法来评价精子获能状态, 经过SDS-PAGE分离后,进行Western免疫印迹分析,检测获能猪精子间酪氨酸磷酸化蛋白的分布.有27,47 ku的2种蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中27 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势,而 47 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养1.5 h时最高,后呈递减趋势,1.5 h时获能状态最佳.     

NAC对河南华溪蟹卵巢镉氧化损伤的缓解作用

采用慢性镉暴露同时加入不同浓度N-乙酰半胱氨酸(NAC)的方法,以河南华溪蟹卵巢组织镉含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,脂质过氧化水平(MDA含量)和卵巢组织细胞结构的变化为指标,探究了NAC对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)卵巢镉氧化损伤的缓解作用。实验设置对照组、镉(0.725 mg·L~(-1))单一作用组、镉(0.725 mg·L~(-1))和NAC(0.1、0.2、0.4 g·L~(-1))联合作用组,结果显示:镉单一作用下,卵巢组织镉含量和MDA含量显著高于对照组;SOD、CAT和GPx活性在不同时间点显著升高;组织显微结构出现不同程度损伤。NAC和镉联合作用下,卵巢组织镉含量在14 d和28 d显著降低;SOD活性于14 d显著降低;CAT、GPx活性和MDA含量均在28 d降低,并逐渐恢复到正常水平;随着时间的延长和NAC浓度的增加,卵巢组织细胞损伤程度出现改善,核膜逐渐完整,仅有少量染色质凝集,细胞内及细胞核内空泡化现象基本消失,卵巢组织结构趋于正常化。实验结果表明,NAC对镉诱导的河南华溪蟹的生殖毒性具有缓解作用,同时进一步证实了氧化损伤是镉生殖毒性的重要机制之一。     

金雀异黄酮对冻融猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及获能相关基因表达的影响

【目的】探究金雀异黄酮对冻融猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及获能相关基因的影响,为丰富猪精子冷冻保存技术的理论基础及后续开展蛋白酪氨酸激酶抑制剂对冻融猪精子获能影响研究提供参考依据。【方法】采集猪精液后,设精液冷冻对照组(CK组)、100.0μmol/L金雀异黄酮冷冻处理组(G组)和鲜精组(F组),使用Western blotting、SDS-PAGE、免疫荧光、ELISA和实时荧光定量PCR等检测各组精子的蛋白酪氨酸磷酸化水平、精子不同部位蛋白酪氨酸磷酸化位点变化情况、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)活性及黏附蛋白家族基因(AQN1、AQN3、AWN、PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ)和精子运动抑制因子(SPMI)基因mRNA的表达水平,分析金雀异黄酮对冻融猪精子的保护机制。【结果】与CK组相比,G组的32和69 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平、顶体+顶体后区磷酸化位点、PKA活性显著降低(P0.05,下同);AWN基因相对表达量极显著升高(P0.01,下同),PSP-Ⅰ基因相对表达量显著降低,PSP-Ⅱ和SPMI基因相对表达量极显著降低。F组中未检测到32和69 kD蛋白酪氨酸磷酸化,而37和58 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平和PKA活性显著降低;AQN1、AQN3和AWN基因相对表达量极显著升高,PSP-Ⅱ基因相对表达量显著降低,SPMI基因相对表达量极显著降低。【结论】金雀异黄酮既能降低冻融猪精子顶体+顶体后区蛋白酪氨酸磷酸化水平,且PKA活性降低可能与p32和p69蛋白表达量降低有关,又可有效提高冻融猪精子中AWN基因及有效降低PSP-Ⅰ、PSP-Ⅱ和SPMI基因的表达量,在一定程度上提高冻融猪精子质量。     

小鼠精子体外培养过程中Ca~(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。     

氟对精子毒性作用的研究进展

氟是一种全身性毒物,除累及牙齿、骨骼外,还对非骨相的多种组织和器官有损害作用,氟对生殖系统的损伤作用已经引起了广泛的关注。从氟对动物精子及人类精子的毒性作用入手,探讨了氟对精子的毒性作用机理,以期人们能更深入地研究氟的生殖毒性机理。     

液态甲醛对雄性小鼠生殖系统的毒性作用研究

为探讨液态甲醛对雄性小鼠生殖细胞的毒性和致突变作用,选用雄性昆明种小鼠为研究对象,进行液态甲醛腹腔染毒,7 d后测定睾丸脏器系数、精子数目、精子形态及精子畸形率及精子微核率。结果表明:中、高剂量组(2.0、20.0 mg/kg)甲醛具有明显的生殖毒性,小鼠睾丸指数、精子数量明显降低,小鼠精子存活率、活动率都受到显著影响;中、高剂量组的精子畸形率、微核率与阴性对照组比较,有显著性差异。由此说明,液态甲醛对雄性小鼠的生殖细胞具有明显的毒性和致突变作用。     

Cd对植物的氧化胁迫机理研究进展

土壤中的重金属污染尤其是镉(Cd)污染是目前全球关注的环境热点问题之一。Cd对于人体和动植物都是非必需元素,且有很强的毒性。Cd对植物的毒害机理研究相对人体和动物起步较晚,最近也逐渐成了重金属研究的焦点。越来越多的研究证实Cd对植物的毒害首先是作用于细胞内的氧化还原系统,造成活性氧(ROS)积累-氧化胁迫,进而引起一系列氧化还原反应,使抗氧化系统发生改变。本文回顾和总结了进入植物体内的Cd与植物的抗氧化系统关系的研究进展,详细阐述了其氧化胁迫的可能机理,并提出了新的研究方向。     

镉对植物光合作用及氮代谢影响研究进展

镉是毒性最强的环境污染物之一。植物中积累的镉可通过食物链进入人体,给人类健康带来潜在危害。镉能抑制植物生长,能使植物形态、生理生化及结构发生改变。镉可减少净光合速率,损伤光合器官;使叶绿素含量下降;抑制气孔开放,从而影响植物的光合作用;镉通过改变植物硝酸还原酶(NR)、谷胺酰氨合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)以及谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性,进一步影响植物氮代谢过程。光合作用及氮代谢在植物生长发育过程中起着十分重要的作用,综述了重金属镉对植物光合作用及氮代谢的影响,并对其机理进行了探讨。     

铅对斑马鱼生殖系统毒性作用研究

[目的]研究Pb对斑马鱼生殖系统的毒性作用。[方法]将成年斑马鱼(3月龄)随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(0.4mg/L)、中(0.8 mg/L)、高(1.6 mg/L)剂量PbAc染毒组,每组20条,连续染毒7 d。染毒结束后,测定雌性斑马鱼产卵数和雄性斑马鱼产精子体积以及精子密度。[结果]与对照组相比,0.4和0.8 mg/L Pb染毒组斑马鱼产卵数较低,差异均有统计学意义(P<0.05);1.6mg/L Pb染毒组斑马鱼已不产卵。随着染毒剂量的增高,斑马鱼产卵数呈减少趋势。各Pb染毒组雄性斑马鱼精子密度与对照组比较,差异均无统计学意义。与对照组比较,0.4、0.8和1.6 mg/L Pb染毒组雄性斑马鱼精子体积均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。置换交配试验结果也是类似。[结论]Pb染毒可对成年斑马鱼产生生殖毒性。     

五味子对心血管系统作用的研究

五味子含有多种有效成分,可减少氧自由基对心肌细胞的损伤,抑制中性粒细胞的浸润,对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用;还可舒张血管,降低血压,调节心肌细胞能量代谢,降低心肌收缩力,降低血脂,并产生抗血小板聚集作用.     

汞镉离子对鲫鱼胚胎发育和仔鱼的毒性效应

[目的]研究Hg2＋、Cd2＋对鲫鱼胚胎发育和仔鱼生长的毒性效应。[方法]用不同质量浓度的Hg2＋、Cd2＋以及Hg2＋＋Cd2＋的混合溶液处理鲫鱼受精卵和仔鱼,观察重金属离子对受精卵和仔鱼发育的毒性效应。[结果]在试验浓度范围内,Hg2＋、Cd2＋对鲫鱼胚胎死亡率随着质量浓度的增加而逐渐增大,出膜仔鱼数和胚胎孵化率随着质量浓度的增加而逐渐降低,与对照组差异显著;Hg2＋、Cd2＋对鲫鱼胚胎的毒性大小顺序为Hg2＋〉Hg2＋＋Cd2＋〉Cd2＋。Hg2＋、Cd2＋对仔鱼死亡率随着质量浓度的增加和染毒时间的延长而逐渐加大,质量浓度为8.0 mg/L的Cd2＋染毒24 h时,仔鱼累积死亡率达到100%;0.25 mg/L的Hg2＋和0.25 mg/LHg2＋＋0.50 mg/L的Cd2＋染毒72h时,仔鱼累积死亡率39%和32%;在染毒浓度为4.00 mg/L的Cd2＋、2.00 mg/L的Hg2＋和1.00 mg/LHg2＋＋2.00 mg/LCd2的条件,仔鱼畸形率较高,分别为40.2%、32.4%和30.2%;在Hg2＋、Cd2＋混合实验组0.25 mg/LHg2＋对8.00 mg/L的Cd2＋有抑制作用;Hg2＋、Cd2＋对鲫鱼仔鱼的毒性大小顺序为Cd2＋〉Hg2＋＋Cd2＋〉Hg2＋。[结论]Hg2＋、Cd2＋对鲫鱼胚胎发育和仔鱼生长均具有较强的毒性效应。     

莠去津和芴对斑马鱼胚胎的联合毒性效应研究

为了研究莠去津和芴的联合毒性效应,以斑马鱼作为模式生物,进行胚胎发育暴露实验、联合毒性模型预测和靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明,在联合暴露120 h后的斑马鱼仔鱼中均观察到异常发育情况,会引起斑马鱼胚胎卵黄囊异常和脊柱弯曲,其毒性作用方式分别为拮抗作用和协同作用,且无论低高剂量下,二元联合暴露比单一暴露时毒性风险更高。靶向代谢组学研究发现,污染物主要通过干扰甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸代谢等途径影响斑马鱼仔鱼的氨基酸代谢。研究表明,莠去津和芴的联合暴露对斑马鱼胚胎的神经发育、氧化应激、抗炎机制、能量代谢、免疫和细胞凋亡机制等生理功能可能产生影响,进而影响其生长发育,且卵黄囊异常是较为敏感的毒性指标。