不同睾丸注射方法对转基因效率的影响

将pEGFP-C1质粒与脂质体混合后注入小鼠睾丸内,30d后观察睾丸形态和组织变化;检测精子和配种后仔鼠转基因阳性率,探讨小鼠睾丸网、曲精细管和睾丸间质3种注射方法对转基因小鼠生产效率的影响。结果显示:3种不同注射方法对小鼠睾丸造成损伤由大到小依次为睾丸网注射、曲精细管注射和睾丸间质注射。荧光检测小鼠精子,睾丸网和曲精细管注射法阳性率分别为(35.13±1.72)%和(15.13±1.45)%,睾丸间质注射法没有观察到阳性精子。PCR检测仔鼠,三者的转基因效率分别为33.3%、12.5%和0。     

铅胁迫对小鼠精子发生和精子活力的影响及机制

[目的]本文旨在探讨铅对小鼠精子发生和精子活力的影响及机制。[方法]建立铅胁迫试验小鼠模型;涂片观察精液品质并拍照;制备精子悬液,用穗加精液分析(SSA)自动检测系统测定精子运动学参数及精子活力参数;用荧光定量PCR检测Oct4、DAZ1、SCP3、Tsc21、ACR、Acrv1、cyclinA1、SPATA46和LDH-C4基因的表达水平;观察睾丸组织形态,计数生精小管数和生精细胞数。[结果]与对照组相比,铅胁迫下小鼠活动精子的比例低于50%,精子形态普遍异常;精子曲线运动速度、直线运动速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、鞭打频率、平均角位移与对照组相比均极显著下降(P0.001),精子运动的直线性、前向性、摆动性与对照组相比无显著差异(P0.05),精子活力极显著下降(P0.001);Oct4和DAZ1基因表达水平极显著降低(P0.001),SCP3、ACR和Acrv1基因表达水平极显著下降(P0.01),cyclinA1和SPATA46基因表达水平显著降低(P0.05),而Tsc21和LDH-C4基因表达水平无显著差异(P0.05)。睾丸生精小管和生精细胞数均极显著减少(P0.001),部分生精细胞坏死,并在生精细胞坏死集中区域可见支持细胞增多,未见成熟的精子,睾丸间质炎性浸润,间质细胞数明显减少。[结论]铅胁迫可引起睾丸间质细胞损伤和生精障碍。铅可能通过下调Oct4、DAZ1、SCP3和SPATA46基因表达,使精子数量减少,精子成熟停滞,畸形精子数增加,精子活力下降。     

内分泌干扰素氰戊菊酯对成年雄性小鼠繁殖生理的影响

为了探讨氰戊菊酯对雄性小鼠繁殖性能及生理机制的影响,将成年雄性昆明小鼠用10 mg/kg BW氰戊菊酯连续灌胃40 d,分析其对小鼠精子质量、睾丸组织结构和血清睾酮、雌二醇含量的影响.结果表明:试验组小鼠精子密度与活率和对照组差异不显著,但试验组精子畸形率显著增加.透射电镜结果表明:试验组小鼠睾丸精母细胞线粒体出现肿胀和空泡化,支持细胞线粒体有肿胀现象,并且溶酶体增多,内质网明显扩张.试验组小鼠血清睾酮水平极显著高于对照组,雌二醇水平显著高于对照组.研究结果表明:用10 mg/kg BW氰戊菊酯长期灌胃雄性成年小鼠,可扰乱小鼠雄激素和雌激素的分泌,并影响小鼠的精子发生,导致小鼠繁殖性能下降.     

和田羊睾丸支持细胞的体外培养与分离鉴定

【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持细胞体外培养模型。     

香烟烟雾对雄性小鼠生育能力的影响

为了研究香烟烟雾对雄性小鼠生育能力的影响,将40只C57BL/6J雄性小鼠随机分成烟雾处理组和正常对照组,将2组雄性小鼠分别与未经处理的母鼠一对一交配。统计观察亲本小鼠睾丸组织学改变、精子总数、活动精子比率,以及子代小鼠的平均产仔数、存活率等。结果发现,烟雾处理2周后,子代小鼠的平均产仔数比对照组的低26.03%,仔鼠存活率(吸烟组为87.96%,对照组为93.84%)低6%;精子总数(1.26×105个/mL)和活动精子比率(36%)均分别低于对照组(2.13×105个/mL)和(71%),二者间呈现显著性差异(P<0.001和0.05);组织切片HE染色结果显示:处理组小鼠睾丸组织的正常结构遭到破坏,变得松散,其中的精子数量减少,形态异常。结果表明,香烟烟雾可引起雄性小鼠睾丸组织生精功能障碍,出现精子减少、精子形态异常等病理变化,导致子代出生数和存活率下降。     

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

类叶升麻苷对肾阳虚小鼠补肾壮阳作用的研究

腹腔注射氢化可的松建立小鼠肾阳虚模型,类叶升麻苷[40、20 mg·(kg·d)-1]连续灌胃14 d.测定阴茎勃起潜伏期、性器官脏器系数、精子数量,光学显微镜观察睾丸形态结构.研究管花肉苁蓉化学成分类叶升麻苷对肾阳虚小鼠的补肾壮阳作用.结果表明:与模型组比较,类叶升麻苷(40 mg·kg-1)可极显著缩短阴茎勃起潜伏期(P＜0.01),增加精子数量(P＜0.01),显著提高性器官脏器系数,改善睾丸形态结构.低剂量类叶升麻苷亦可缩短勃起潜伏期(P＜0.01),增加精子数量(P＜0.05),提高性器官脏器系数(P＜0.05),改善睾丸形态结构.证明类叶升麻苷对肾阳虚小鼠具有补肾壮阳作用.     

4Gy60Co γ射线对Balb/c小鼠睾丸辐射损伤效应的研究

目的 探讨4 Gy⁶⁰Co γ射线对Balb/c小鼠睾丸的辐射损伤效应。方法 将60只Balb/c小鼠根据体质量按随机数表法分为正常组和辐射组,每组30只。对辐射组小鼠给予4 Gy⁶⁰Co γ射线一次性全身照射,并分别在照后14、21、35 d取材,检测小鼠睾丸指数,睾丸病理变化,精子浓度、活率、活力、正常形态率、血清激素等指标。结果 与正常组比较,辐射组小鼠睾丸指数在照后14、21、35 d时均显著降低（P<0.001）;辐射后14 d时,辐射组小鼠精子浓度、精子活率、活力以及正常精子形态率均无显著性差异,而小鼠血清睾酮显著升高（P<0.05）;辐射后21 d时,辐射组小鼠精子浓度、精子活率和精子活力以及正常精子形态百分比均显著降低（P<0.01）;照后35 d时,辐射组小鼠精子浓度、精子活率、精子活力以及正常精子形态百分比均显著降低（P<0.001）;4 Gy⁶⁰Co γ射线对小鼠血清黄体激素和促卵泡素的影响不显著（P>0.05）。结论 4 Gy⁶⁰Co γ射线对Babl/c小鼠睾丸损伤严重。     

不同品种小鼠实验性自身免疫性睾丸炎模型的建立

[目的]研究ICR、BALB/C以及C57三种品系的雄性小鼠对实验性自身免疫性睾丸炎(EAO)的易感性。[方法]将每种品系的12只健康雄性小鼠随机分为对照组与EAO组,每组6只。对小鼠进行皮下注射,每次0.2mL,注射3次,两次间隔2周。对照组小鼠皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)乳化的PBS;EAO组小鼠皮下注射完全弗氏佐剂乳化的同系睾丸匀浆。在第一次免疫注射50d后,取小鼠附睾尾与输精管检测精液品质;取小鼠睾丸制作切片,HE染色后用于组织病理学观察。[结果]结果显示,与对照组相比,BALB/C小鼠EAO组的精子密度显著降低,ICR与C57小鼠EAO组的精子密度无显著变化;3种品系小鼠EAO组的精子活力和活率都显著降低;BALB/C小鼠EAO组的睾丸损伤严重,ICR与C57小鼠EAO组的睾丸损伤不太明显。[结论]由此表明,BALB/C品系的小鼠比ICR与C57小鼠更易诱导EAO。     

转基因大豆对雄性鼠生殖系统的安全性评估

以含转基因豆粕饲料喂食小鼠,观察对雄性小鼠生殖系统的影响。喂食小鼠120d后,通过PCR方法检测外源基因在睾丸中的存在情况;对睾丸组织制作石蜡切片,观察睾丸组织的病理损伤情况;通过流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例;通过彗星电泳检测小鼠精子DNA损伤情况。结果表明:在睾丸组织中未检测到外源基因;睾丸组织切片未发现明显的病理学变化;试验组与对照组小鼠睾丸组织中各生殖周期精细胞比例无显著差异;未检测到精子DNA损伤。说明喂食转基因饲料对小鼠的生殖系统无显著影响。     

蜂王浆对雄兔生长及繁殖性能的影响

 【目的】探讨蜂王浆提高动物繁殖性能的作用机理。【方法】高、低剂量组分别按体重0.2%和0.1%的量对2月龄的雄性日本大耳兔每天空腹灌胃新鲜蜂王浆,对照组灌胃0.1%体重的生理盐水。每周同一时间称重;70 d后分别检测精子密度、活力和畸形率;80 d后分别屠宰,分离主要脏器并计算脏器系数;右侧睾丸制作石蜡切片进行组织形态观察。【结果】（1）第0—8周,高、低剂量组与对照组每周龄体重差异不显著（P＞0.05）;9周后,高、低剂量组每周龄体重都显著高于对照组（P≤0.05）。屠宰测定时,高、低剂量组的雄兔睾丸、下丘脑和脾3个脏器系数都极显著大于对照组（P≤0.01）,而脑、肺、心、肝、肾和膀胱等主要脏器系数差异不显著（P＞0.05）。（2）高、低剂量组的精子密度都极显著大于对照组（P≤0.01）;低剂量组的精子活力极显著高于对照组（P≤0.01）,而对照组又极显著高于高剂量组（P≤0.01）。（3）灌胃80 d后,对照组雄兔睾丸曲细精管生精上皮细胞数量明显少于蜂王浆灌胃组。生精上皮较薄,生精上皮细胞排列疏松,中央的管腔更大,管腔内出现的细胞大部分为初级精母细胞和次级精母细胞;而蜂王浆灌胃组的曲细精管管腔相对缩小,被精子细胞以及精子所充实,细胞层数增多,精原细胞附于基膜上,初级精母细胞、精子细胞和精子依次紧密排列延伸至管腔内,核染色明显,管腔中可见大量的精子。【结论】蜂王浆灌胃能促进雄兔下丘脑、睾丸等生殖器官的发育;灌胃体重0.1%的蜂王浆对精子密度和精子活力都有明显的提高作用。     

不同品系小鼠精子冷冻及冻融精子体外受精的研究

采用小鼠精子冷冻、冻融精子体外受精的方法,进行小鼠保种、引种、生物净化及品系标准化的可行性研究,并初步探究小鼠精子冷冻的影响因素。实验选用同一年龄5种不同品系小鼠分别进行精子冷冻、复苏,并比较各品系冷冻效果及冻融精子的体外受精(IVF)率。结果显示,冷冻后各品系小鼠精子复苏存活率约在15%～50%之间;冻融小鼠精子体外受精结果随遗传背景的不同差异显著,受精率分别为:KM小鼠68.4%、ICR小鼠30.3%、DBA/2J小鼠47.2%、C57BL/6J小鼠6.8%、BALB/cA小鼠25%。冻融精子IVF得到的胚胎可以耐受体外培养。     

热应激对公兔精液品质、睾丸组织形态及抗氧化指标的影响

为探讨热应激对公兔精液品质、睾丸组织形态及抗氧化物活性的影响,分别测定高温（31±2）℃与适温（18＋2）℃条件下公兔采精量及精子活力、密度、畸形率,并取睾丸组织制作石蜡切片进行组织形态观察及制成组织匀浆测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GsH—Px）、总抗氧化能力（T—AOC）。结果表明：热应激致使公兔采精量、精子活力和密度显著下降（P〈0．05）,睾丸组织细胞严重损伤、数量减少,睾丸组织中MDA含量显著增加（P〈0．05）,而SOD、GSH—Px活性和T—AOC显著降低（P〈0．05）。可见,热应激导致公兔精液品质下降,可能与睾丸组织中抗氧化酶活性降低、自由基生成过多、睾丸组织细胞受损有关。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

纳米硒对性成熟前雄性波尔山羊生殖机能发育的影响

 【目的】研究日粮添加纳米硒对断奶雄性山羊性成熟过程中生殖机能的影响。【方法】选用2月龄断奶、体重一致的波尔山羊公羔羊20只,随机分成2组,对照组饲喂基础日粮,处理组饲喂基础日粮+纳米硒（硒含量0.3 mg?kg-1）,预饲10 d,试验期90 d,每30 d采血分离血清测定FSH、LH和T浓度,分离睾丸测定睾丸硒浓度和GSH-Px活性,同时制作常规石蜡切片观察睾丸组织结构。试验结束时采集精液分析精液品质,分离精子,透射电镜观察精子超微结构。【结果】纳米硒可促进睾丸曲精细管和间质组织及间质细胞发育,维持曲精细管中生殖细胞的发生、分化及分裂;日粮补充纳米硒极显著增加睾丸硒沉积、提高睾丸GSH-Px活性(P＜0.01);30～60 d阶段纳米硒不影响血清生殖激素水平(P＞0.05),0～90 d阶段FSH、LH和T显著升高;纳米硒对射精量和精子密度无影响,精子活力增加10%,畸形精子数目降低27%。透射电镜观察精子超微结构,对照组精子尾部中段线粒体结构改变,排列疏松。【结论】纳米硒显著影响性成熟前公羔羊睾丸的发育,增加精子活力,降低畸形精子数,对血清生殖激素水平有一定影响。     

黑尾近红鲌精子活力研究

在水温23℃的条件下,对黑尾近红鲌(Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu)精子在不同浓度氯化钠溶液、不同水体以及不同离体时间情况下的活力进行了研究。结果表明,1在0~1.2%的氯化钠溶液中,氯化钠浓度小于0.5%时,随着浓度的增加,黑尾近红鲌精子快速运动时间随之延长;在0.5%氯化钠溶液中,精子快速运动时间最长(52.00±3.46 s),与其他组别差异显著(P0.05);当浓度大于0.9%时,精子未激活。2精子在蒸馏水中的快速运动时间(36.33±1.15 s)显著(P0.05)高于在自来水(32.00±1.00 s)和池塘水(27.67±1.52 s)中。3采用蒸馏水激活离体精子1~15 h,随着时间的延长,存活精子快速运动时间无显著差异(P0.05),而精子成活率显著降低(P0.05)。     

小鼠精原细胞体外培养的研究

采用不同的酶分步消化,分离培养小鼠的支持细胞和精原细胞,并根据它们的不同特性采用不同的染色方法进行鉴定.利用支持细胞对精原细胞的支持和营养作用,使支持细胞和精原细胞共培养,对精原细胞在体外分化时的条件要求作了研究.结果:获得了能进行分化的精原细胞,而且已经分化到个体变小,细胞核偏向一侧的细胞.结论:通过体外培养精原细胞获得精子细胞是可行的.     

不同饲养层对兔原始生殖细胞传代培养的影响

为了探讨不同饲养层细胞对兔原始生殖细胞体外培养与传代的影响,从14~18 d的兔胎儿生殖嵴中分离得到原始生殖细胞(PGCs),分别培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、兔胎儿成纤维细胞(REF)饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)、兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。观察兔类EG集落的生长状态,并检测其碱性磷酸酶活性。结果表明:4种方法均能分离克隆出兔类EG集落,碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法传代培养兔PGCs。     

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子抗氧化酶活性的影响

为了探讨超低温（-196℃）对精子的损伤机理,采用试剂盒测定了冷冻前后俄罗斯鲟精浆和精子中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）和谷胱甘肽还原酶（GR）等酶活性。结果表明,经过超低温冷冻保存后,俄罗斯鲟精子活力下降,添加抗冻保护液冷冻后的精浆中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著升高（P〈0．05）,较未添加保护液组显著降低（P〈0．05）,GR的活性则显著低于鲜精组（P〈0．05）,但显著高于未添加保护液组（P〈0．05）;添加抗冻保护液冷冻后的精子中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著降低（P〈0．05）,较未添加保护液组显著升高（P〈0．05）,GR活性则显著高于鲜精组（P〈0．05）,但显著低于未添加保护液组（P〈0．05）。这说明超低温冷冻对俄罗斯鲟精子的抗氧化系统产生了较大影响,成为影响精子活力的一个重要原因。     

视黄醇对仔猪睾丸支持细胞体外生物学特性的影响

支持细胞是构成曲细精管上皮的重要组成细胞,视黄醇及其衍生物是雄性动物睾丸发育和精子发生中所必须的物质,支持细胞是睾丸内视黄醇及其衍生物作用的靶细胞。本研究以3~5周龄仔猪睾丸支持细胞为材料,通过分析视黄醇对体外支持细胞活力、增殖和凋亡相关基因表达、相关细胞因子转录及合成的影响,评价视黄醇对支持细胞体外生物学特性的影响。结果显示,与对照组相比,视黄醇添加浓度达到5.000、0.125 μmol·L^-1时,显著抑制培养24 h和72 h的细胞活性(P<0.05);添加1.250 μmol·L^-1视黄醇组和对照组相比,增殖相关基因PCNA、BCL-2和C-MYC显著下调(P<0.05),凋亡相关基因BAX显著上调(P<0.05),且支持细胞内GDNF、CSF-1和EGF在基因表达和蛋白质水平上均显著降低(P<0.05)。体外培养条件下,添加视黄醇抑制支持细胞活性,促进细胞凋亡。