过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

基于转录组数据的害虫抗药性综合检测方法

为建立基于转录组数据的害虫抗药性检测方法,以3种重要害虫家蝇Musca domestica、白纹伊蚊Aedes albopictus和小菜蛾Plutella xylostella的8个抗性/敏感种群的转录组数据为对象,使用已开发的乙酰胆碱酯酶抗性突变检测程序ACE检测不同种群中的乙酰胆碱酯酶抗药性突变,并使用Bowtie 2软件和R程序包DESeq2检测其解毒酶基因的表达量变化,分析这3种害虫对有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性分子基础。结果显示,在家蝇2个抗性种群KS8S3和ALHF中检测到ace2基因上发生了G227A抗药性突变,突变频率分别为0.318和1.000;在白纹伊蚊抗性种群Tem-GR中检测到CCEae3a基因的表达量较敏感种群Par-GR上调了7.175倍;在小菜蛾抗性种群ZZ中检测到ace1基因上发生A201S和G227A抗药性突变,突变频率分别为0.656和0.692。根据上述突变频率和解毒酶基因表达量变化评估的3种害虫种群抗药性情况与其之前的报道基本相符,表明基于转录组数据同时对靶标抗性机制和代谢抗性机制进行检测的害虫抗药性综合检测方法可以很好地反映害虫种群的抗药性状况。     

利用加权基因共表达网络分析筛选天农麻鸡胴体性状候选基因

旨在通过转录组测序(RNA-Seq)与加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选慢速型黄羽肉鸡天农麻鸡胴体性状相关候选基因。本研究以104只天农麻鸡为素材,在126日龄时进行屠宰,测定胸肌重等7个胴体性状,采集胸肌组织进行RNA-Seq。基于RNA-Seq数据获得基因表达矩阵后,结合表型进行WGCNA分析,确定目标模块,筛选目标模块的枢纽基因,并分别进行KEGG通路富集、蛋白质互作网络(protein-protein interaction network,PPI)构建和相关性分析。104份胸肌组织RNA-Seq质控后获得15 092个基因的表达量。与胴体表型进行WGCNA,共得到19个模块,其中4个模块与胴体性状极显著相关。功能富集结果表明,目标模块内基因主要富集在ECM-受体相互作用、黏着力等通路。以|Module membership|> 0.8、|Gene significance|> 0.2为标准筛选到58个枢纽基因,并通过PPI网络构建鉴定到5个网络节点基因,整合相关性分析确定COL1A2和SPARC为最重要候选基因。本研究通过大样本量转录组分析,发现ECM-受体相互作用等通路在天农麻鸡胴体性状调控中发挥主要作用,筛选到COL1A2和SPARC是影响全净膛率性状的重要候选基因,研究结果为鉴定选育分子标记,解析胴体性状分子机制奠定理论基础,为慢速型黄羽肉鸡育种提供重要参考。     

ZBED6基因敲除猪肾脏转录组分析

【目的】 探究锌指BED结构域结合蛋白6(zinc finger BED domain-containing protein 6,ZBED6)基因敲除对猪肾脏组织基因转录表达的影响,并解析ZBED6基因调控猪肾脏代谢的靶基因及其通路。【方法】 对8月龄ZBED6基因敲除巴马香猪(ZBED6 KO)和同月龄野生型巴马香猪(WT)的肾脏组织(n=3)进行总RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和差异基因的表达量;以Illumina Hiseq高通量测序技术对ZBED6 KO和WT猪肾脏组织mRNA进行转录组测序(RNA-Seq),用猪Sus scrofa 11.1作为参考基因组序列,通过生物信息学软件TopHat、Cufflink、Cuffmerge和Cuffdiff对测序数据进行分析,筛选ZBED6 KO和WT猪肾脏组织中的差异表达基因,对差异表达基因进行层次聚类和KEGG通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果中差异表达基因的可靠性。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,ZBED6 KO猪肾脏IGF2基因mRNA表达量显著高于WT猪(P<0.05)。测序共获得78 G数据量,每个样本比对率在87.3%以上,测序质量良好;ZBED6 KO和WT猪肾脏组织之间共检测到25 213个基因,以调整后P<0.05和log₂|FoldChange|>2为筛选标准,得到299个差异表达基因,其中上调的基因103个,下调的基因199个。热图和主成分分析(PCA)结果显示,ZBED6 KO和WT组猪肾脏基因组内表达模式相似,组间表达模式不同;KEGG通路富集分析显示,差异基因主要参与视黄醇及疾病代谢相关通路。ZBED6基因敲除后,其中有9个差异表达基因(CYP2C42、AOX1、ENSSSCG00000036274、RDH16、CYP2A19、ENSSSCG00000022724、CYP26B1、CYP1A1、RDH5)被富集到视黄醇代谢通路中,可能参与调控猪肾脏代谢平衡。实时荧光定量PCR检测发现,7个差异表达基因(CYP2C42、AOX1、RDH16、CYP2A19、CYP26B1、CYP1A1、RDH5)的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实RNA-Seq结果的可靠性。【结论】 本试验利用RNA-Seq技术分析了ZBED6基因敲除对巴马香猪肾脏代谢的影响,其通过调控肾脏多个下游基因表达,从而影响其代谢相关信号通路,试验结果为阐明ZBED6基因功能提供了材料。     

野生盘羊×巴什拜羊杂交二代尾部脂肪差异表达lncRNA的鉴定与分析

【目的】 分析不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探究lncRNA与绵羊尾部脂肪沉积机制的关系,为揭示绵羊尾脂沉积机制提供理论依据。【方法】 选择新疆地方绵羊巴什拜羊(肥尾型)和野生盘羊×巴什拜羊杂交二代(小尾型)作为研究对象,采集2个群体尾部脂肪组织,利用转录组测序技术筛选差异表达lncRNA并预测靶基因,对其进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用实时荧光定量PCR技术验证转录组测序的表达结果。【结果】 通过差异表达分析共筛选出728个差异表达lncRNAs,其中270个表达下调,458个表达上调;通过差异表达lncRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析,筛选到634个靶基因参与疾病、免疫、蛋白修饰、细胞代谢等相关功能分类,共涉及76条信号通路,部分lncRNA介导的靶基因SCD、GPAM、THRSP、FASN等与绵羊尾部脂肪沉积相关。实时荧光定量PCR与转录组测序结果趋势相同。【结论】 lncRNA在绵羊脂尾进化中对尾部脂肪沉积具有重要的调控作用,为从lncRNA的角度分析绵羊脂肪沉积提供了理论依据。     

RNA-Seq技术在瘤胃微生物研究中的应用进展

反刍动物瘤胃内多种多样的微生物组成一个复杂的微生态系统,它们在瘤胃内物质消化过程中发挥重要作用。RNA-Seq技术的出现为反刍动物瘤胃微生物的研究提供了前所未有的机遇。本文主要从新一代高通量测序技术出发,阐述RNA-Seq技术在瘤胃微生物代谢酶特性、瘤胃微生物的多样性、瘤胃微生物新功能基因方面的应用,以期为瘤胃微生物的研究提供参考。     

棉花纤维发育早期RNA-Seq转录组分析

 为了揭示棉花纤维发育早期基因表达变化情况,本研究以纤维长度存在显著差异的两个陆海回交近交系NMGA-062（32.58 mm）和NMGA-105（27.06 mm）为材料,利用Illumina HiSeq^TM 2000对0、3 DPA（Days post anthesis）的胚珠及10 DPA的纤维进行RNA-Seq测序。六个文库进行拼接,共得到长度大于200 bp的Unigene 98464个,总长度约为88.2 Mb。对10 DPA的纤维转录组数据进行差异表达分析,共筛选到1931个差异表达基因,1536个Unigene上调,395个Unigene下调。GO（Gene ontology）功能显著性富集和Pathway显著性富集分析发现,差异表达基因富集在脂质转移活性（Lipid transport activity）分子功能组和脂质代谢通路（Lipid metabolism pathway）,由此推测脂类相关基因可能在纤维伸长发育过程中起重要作用。通过对棉纤维发育10 DPA基因转录水平差异比较分析,为深入开展纤维伸长相关功能基因的克隆和功能验证提供了丰富的资源,并为揭示棉花纤维伸长的机制打下了坚实的基础。