猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10¹~3.31×10⁷拷贝·μL^-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R²）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10¹拷贝·μL^-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^6.7、10^5.3拷贝·mL^-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。     

粘质沙雷氏菌中乙偶姻合成途径调控基因的鉴定

粘质沙雷氏菌H30中控制乙偶姻合成的调控因子budR被克隆和鉴定。序列分析表明调控因子budR与液化沙雷氏菌MG1中乙偶姻合成调控因子slaR同源性达80%,属lysR型调控因子。调控因子budR突变可导致粘质沙雷氏菌无法合成乙偶姻,引起培养液pH快速下降和菌体生长缓慢,而在培养过程中维持pH7.0,突变菌的生长可获得恢复,暗示budR的功能为调控粘质沙雷氏菌发酵过程中性产物乙偶姻的合成,以阻止发酵液过度酸化。     

基于中草药数据库细菌群体感应抑制剂的虚拟筛选

研究表明微生物致病性在很大程度上受到群体感应系统的调控,筛选群体感应系统抑制剂被认为是解决微生物致病性的有效方法之一.以铜绿假单胞菌群体感应系统受体蛋白RhlR为研究对象,通过蛋白建模,模拟了RhlR蛋白的空间高级结构,在此基础上运用药物虚拟筛选的方法,从中草药小分子数据库(TCM)中筛选出10个与RhlR结合较好的化合物,并对其中2个化合物(穿心莲内酯和绿原酸)进行了活性测定,结果表明穿心莲内酯和绿原酸均具有较好的抑制群体感应系统活性.     

榆黄蘑母种培养基及栽培配方的优化研究

设计考察不同培养基配方对榆黄蘑母种菌丝走菌及栽培出菇的影响,结果以土豆100 g,蔗糖10 g,琼脂9 g,pH自然,水500 mL的配方6可快速培养母种;以紫薯100 g,葡萄糖10 g,琼脂9 g,pH自然,水500mL的配方2可保持母种菌丝长势良好、活力强。以玉米芯、麸皮为主的生产配方试验比较结果,采用玉米芯66%,麸皮30%,石灰2%,石膏1%,蔗糖1%的配方d,菌丝生长速度、菌丝长势、产量表现较好。以木屑、麸皮为主的生产配方比较试验结果,采用木屑58%,棉籽壳20%,麸皮20%,石灰1%,石膏1%,含水量60%～65%,pH 5.5～7.0的配方F,菌丝生长速度、菌丝长势及产量表现较好。     

不同食用菌品种产漆酶规律的研究

本研究对6种食用菌在液体和栽培料培养时产漆酶能力和产酶规律进行了比较分析。实验结果表明,在液体培养条件下,凤尾菇、秀珍菇和鸡腿菇均在第6天左右达到酶活性峰值,金针菇酶活性持续增加,在第10天达到峰值。在栽培料培养条件下,风尾菇、秀珍菇和鸡腿菇均在大试管中长至一半时达到酶活性峰值,金针菇酶活性持续增加,在原基形成时达到峰值。在2种培养条件下,生长速度较快的凤尾菇、秀珍菇、金针菇f198、鸡腿菇漆酶活性均较高,而生长速度慢的白玉HM03和滑菇漆酶活性较低,漆酶产生规律相同,产漆酶能力较强的菌种菌丝生长较快,产酶高峰多出现较早,而产漆酶能力较弱的菌种菌丝生长较慢。以上结果说明食用菌中漆酶在菌丝生长速度上起着重要的作用,可为以后食用菌提高其生长速度、定向育种提供重要的参考。     

17种中草药细菌群体感应抑制剂的筛选

微生物致病性在很大程度上受到群体感应系统的调控、筛选群体感应系统抑制剂被认为是解决微生物 致病性的有效方法之一。对17 种中草药进行了群体感应抑制剂的筛选、结果表明、其中8 种中草药能抑制 Chromobacterium violaceum CV026 产紫色色素的能力。试管梯度试验表明、这8 种中草药有明显的群体感应抑制效 果。浮游抑制试验结果表明、17 种中草药中的13 种可抑制铜绿假单胞菌的浮游。进一步对中草药中群体感应抑制剂 的分离鉴定、将为揭示细菌群体感应抑制剂的机制研究和应用奠定基础。     

猪链球菌2型安徽分离株多位点序列分型与毒力特征研究

为了解安徽地区猪链球菌2型(SS2)临床分离株毒力基因分布、分子分型特征及其与致病性的相关性,本研究收集了58株源自临床患病猪的SS2,应用PCR技术检测其毒力基因:胞外蛋白因子基因(epf)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和溶血素基因(sly),应用多位点序列分型方法(MLST)对其进行基因分型,并分析其与动物致病性之间的相关性。结果显示,58株分离菌,epf^+/mrp^+/sly^+型为44.83%(26/58),epf^+/mrp^-/sly^+型为25.86%(15/58),epf^-/mrp^+/sly^+型为18.97%(11/58),epf^-/mrp^-/sly^+和epf^-/mrp^-/sly^-型均为5.17%(3/58)。共分出10种ST型,其中ST1 26株(44.83%),ST7 18株(31.03%),ST28 6株(10.34%),ST117、ST156和ST308均为1株,各占1.72%,另有4种新发现的ST型,即ST958 2株(3.45%),ST957、ST959、ST970各1株(1.72%);分为4种克隆复合物(ST1 complex、ST27 complex、ST87 complex、ST188 complex)。ST1以epf^+/mrp^+/sly^+型为主(69.23%),其中23株(88.46%)分离自全身感染病猪;ST7以epf^+/mrp^-/sly^+型为主(55.56%),其次为epf^+/mrp^+/sly^+型(38.89%),其中13株(72.22%)分离自全身感染病猪。通过对斑马鱼、昆明鼠感染试验和LD50的测定,筛选出的6株强毒菌株分为ST1型(2株)和ST7型(4株)。结果表明,epf^+/mrp^+/sly^+是安徽地区SS2的优势毒力基因型,其次为epf^+/mrp^-/sly^+型。获得10种ST型,其中4种为首次发现,并且ST1和ST7为优势型。具有ST1/epf^+/mrp^+/sly^+遗传特征的菌株在临床上均倾向于导致全身感染。本研究结果揭示了安徽地区SS2毒力基因型、MLST遗传特征与毒力、动物临床症状之间的相关性,为开展SS2流行病学研究,区分不同菌株间毒力差异的研究提供参考依据。     

粘质沙雷氏菌中乙偶姻合成途径基因克隆、序列分析及表达

运用生物信息学和PCR方法,鉴定了粘质沙雷氏菌乙偶姻生物合成途径中编码α-乙酰乳酸脱羧酶(a- ALDC)和α-乙酰乳酸合成酶(α- ALS)的基因(aceA和aceB)序列.经测序和序列分析显示aceA和aceB基因的开放阅读框(ORF)长度为780 bp和1 686bp,编码259和561个氨基酸,编码蛋白分子量和...