CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的分泌表达

有研究证实,霍乱毒素(CT)A1亚基与葡萄球菌G蛋白的D肽偶联构建的融合蛋白CTA1-DD具有良好的佐剂效果。为了获得重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达,将CTA1-DD基因连接到表达载体pHT43中,构建重组枯草杆菌表达载体pHT43-CTA1-DD。将重组载体转化到枯草芽胞杆菌WB600中,用IPTG诱导重组菌表达,发酵液离心后取上清液,通过SDS-PAGE和Western blot方法分析蛋白表达情况。发酵上清液经Ni-IDA琼脂糖树脂纯化,与流感病毒HA抗原混合后共同滴鼻免疫小鼠后采集小鼠血清和支气管肺泡灌洗液检测IgG和IgA的抗体水平。结果显示：重组CTA1-DD蛋白在枯草芽胞杆菌中能够分泌表达,在发酵罐中发酵36 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小在42 kDa左右,蛋白产量最高能到700μg/mL,Western blot检测目的蛋白正确表达。重组蛋白经过Ni-IDA琼脂亲和层析纯化后与HA抗原混和滴鼻免疫小鼠,ELISA结果显示CTA1-DD蛋白组针对HA抗原能够诱导更高的血清IgG和黏膜IgA抗体水平,说明枯草芽胞杆菌表达的CTA1-DD蛋白具有佐剂活性...     

拟态弧菌的绿色荧光蛋白标记及其在感染草鱼体内的动态分布

为了示踪研究拟态弧菌感染草鱼的动态过程,将增强型绿色荧光蛋白编码基因EGFP克隆至质粒pBAD24,并转化到拟态弧菌04-14菌株构建荧光标记重组菌.重组菌经阿拉伯糖诱导后,能高效表达EGFP蛋白;荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均发现重组菌能够发出明显的绿色荧光信号,且传至30代后质粒稳定率仍为100％;生物学特性检测结果显示,与野生株相比,重组菌的形态、生长特性和细胞黏附性均未发生明显改变.用标记重组菌浸泡感染草鱼,定点采集鳃、肠道、肌肉、头肾、脾脏和肝脏,借助荧光信号检测4d内细菌在不同组织脏器中的动态分布.结果发现感染4h后即可在肠道和鳃中检测到绿色荧光信号,标记菌检出量分别为3.60×108和2.36×106 CFU/g,直至10 h,其含量无明显变化,12 h后含菌量逐渐下降,但持续存在直至鱼死亡.标记菌在肌肉、头肾、脾脏和肝脏中呈现相似的动力学,感染24 h后才检测到荧光信号,24～ 85 h时间段含菌量呈现先增加后下降的变化,48 h达到峰值,检出量分别为9.58×104(肌肉)、8.75×104(头肾)、1.50×104(脾脏)和4.50×104 CFU/g(肝脏),但均低于肠道中的检出量,结果表明肠道是拟态弧菌黏附定植与繁殖的主要靶器官.     

免疫增强剂CVC1302辅助抗原诱导小鼠机体产生长效体液免疫应答的研究

[目的]本试验旨在探究免疫增强剂CVC1302促进淋巴滤泡生发中心(GC)应答的作用机制.[方法]将模式抗原4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗NP-CVC1302,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠.免疫后不同时间点,利用NP-BSA作为捕获抗原检...     

包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的制备及佐剂活性

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得到稳定保护。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的粒径为50～150 nm, Zeta电位约-50 mV,质量浓度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制备的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒载药率25.33%,包封率86.56%。体外模拟释放试验结果显示CTA1-DD蛋白可在7 d内缓慢释放。将CTA1-DD蛋白与PRV灭活抗原混合后,接种至小鼠鼻腔,结果表明,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒能够同时诱导更高的血清IgG抗体和黏膜IgA抗体表达,证明了其作为黏膜佐剂的高效性。     

PEDV亚单位疫苗免疫增强剂的筛选

为了研究PEDV的新型亚单位疫苗,提高PEDV亚单位疫苗的免疫原性,选取免疫增强剂CVC1302、CVC1303与国家兽用生物制品工程技术研究中心构建的可溶性表达PEDV S蛋白核心表位COE的重组蛋白(p QZCOE-LTB)混合乳化制成疫苗,免疫4周龄的ICR小鼠,首免14 d后加免1次,随后采集首免14(加强免疫前),21,28,55 d的小鼠血清,分别用琼扩试验的方法定性检测血清IgG抗体以及用ELISA试剂盒定量检测小鼠血清IgG抗体滴度动态变化,肠组织sIgA抗体滴度。结果表明,重组蛋白与CVC1303配合使用免疫小鼠能产生显著高于灭活苗(CV777)阳性对照组的IgG和sIgA抗体水平,说明CVC1303免疫增强剂能有效增强该重组蛋白的免疫原性,提高亚单位疫苗免疫效果。     

乙型脑炎病毒感染猪睾丸细胞的miRNA表达谱差异分析

[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。     

免疫增强剂CVC1302诱导高亲和力抗体机制分析

为探究免疫增强剂CVC1302诱导机体产生高亲和力抗体的免疫机制,本研究利用4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与免疫增强剂CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗。将33只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组,分别后腿肌肉注射NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL疫苗,50 μg NP-OVA/只,利用ELISA检测高亲和力NP特异性抗体水平;利用流式细胞仪分析生发中心B细胞增殖水平、生发中心 B细胞诱导活化的胞苷脱氨酶(AID)表达水平;利用荧光定量PCR检测AID基因和HoxC4基因转录水平。结果表明:1)免疫增强剂CVC1302可诱导小鼠产生高亲和力的NP特异性抗体。2)免疫增强剂CVC1302可显著提升抗原特异性生发中心 B细胞数量占总B细胞数量比例。3)免疫增强剂CVC1302可显著增加生发中心 B细胞HoxC4基因转录水平。4)免疫增强剂CVC1302可显著增强生发中心B细胞AID蛋白表达水平。生发中心B细胞表达的AID可针对B细胞免疫球蛋白序列可变区进行点突变,发生体细胞高频突变,提升B细胞BCR针对抗原的亲和力,进而在辅助性T细胞的阳性选择下分化为长寿浆细胞,持续性分泌高亲和力抗体,因此本研究推断免疫增强剂CVC1302依赖于正向调控AID诱导机体产生高亲和力抗体,为机体提供免疫保护力,以抵抗病原体的感染,为后续新型免疫增强剂的研制提供思路和理论基础。     

伪狂犬活/灭活病毒接种小鼠诱导免疫效力及差异因子比较

[目的]本研究旨在比较活/灭活病毒进入体内后对免疫系统活化的差异，为免疫增强剂的筛选和评价建立高效动物模型。[方法]本试验利用伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株建立小鼠伪狂犬人工感染模型，筛选活/灭活病毒接种小鼠后免疫相关差异因子。将PRV Bartha-K61活毒以不同剂量、不同方式感染小鼠，通过计算小鼠存活率确定最佳感染剂量与感染方式；将筛选的最佳剂量的伪狂犬病毒活毒与相同剂量下灭活病毒按照前述筛选的最佳感染方式接种小鼠，利用ELISA试剂盒检测免疫7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6水平；利用PRV gB ELISA检测免疫7 d后小鼠血清PRV特异性gB抗体水平；利用灭活PRV作为特异性抗原进行淋巴细胞增殖试验并计算各组淋巴细胞刺激指数(SI)。[结果]在保证小鼠存活的前提下，6～8周龄小鼠的PRV的安全感染剂量为5×10⁴ TCID50;同等剂量下，相比于肌肉和腹腔注射，皮下注射为最安全的感染方式；同等剂量的活毒和灭活病毒接种小鼠后，与灭活病毒组相比，活病毒感染7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平显著...     

刀豆蛋白A纯化猪流行性腹泻病毒的研究

为开发一种新型高效、低成本的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)抗原纯化方法，本研究尝试了一种基于凝集素(刀豆蛋白A，Con A)的PEDV浓缩纯化方法。通过Con A与PEDV病毒粒子的特异性结合，形成Con A-PEDV复合物，然后通过低速离心和竞争性解离即可实现病毒纯化。结果表明:1)当Con A的使用浓度为80 μg/mL，室温作用2 h，4 000 r/min离心15 min时，纯化效果较佳；2)利用Tris-HCl缓冲液(pH 7，0.01 mol/L，内含200 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L NaCl)进行解离时，较PBS缓冲液有更高的解离效率；3)该方法病毒回收率大约为80%，总蛋白去除率可达90%。综上，本研究利用Con A纯化PEDV是可行的，为高质量PEDV灭活疫苗的研发奠定基础。     

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性...