外源氯化钙对低温胁迫下胡椒抗寒生理指标的影响

以中国胡椒主栽品种‘热引1号’胡椒为材料,设置4个不同浓度氯化钙（7、14、21、28 mmol/L）处理,以去离子水为对照,低温胁迫4 d（10 ℃/5 ℃,12 h/12 h）,恢复培养6 d（28 ℃/20 ℃,12 h/12 h）,观察表型并测定各处理的光合参数、抗氧化酶活性及渗透性物质含量变化情况。结果表明：7 mmol/L氯化钙处理胡椒可以改善寒害表型,随氯化钙浓度升高寒害表型逐渐加重;外施7 mmol/L氯化钙能够显著改善胡椒的净光合速率,随氯化钙浓度升高,净光合速率越来越低,氯化钙浓度过高时（达到28 mmol/L）净光合速率低于CK;与CK相比,外施7 mmol/L氯化钙能够显著提高抗氧化酶活性、增加可溶性糖含量、降低丙二醛含量。随处理浓度升高,抗氧化酶活性和可溶性糖含量越来越低,丙二醛含量越来越高。本研究结果为胡椒生产上抗寒技术指导和抗寒分子育种提供了参考。     

胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因的部分序列设计引物,运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为Pn4cl,长度2130 bp,开放阅读框1638 bp,编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa,理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase (AMP-forming) /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域,具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn4CL与北细辛的同源性最高,同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起,与菊分支的进化距离较近,与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明,该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明,该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达,同时接种辣椒疫霉菌后,Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。     

菠萝蜜类胡萝卜素检测方法研究及呈色物质分析

为研究菠萝蜜果肉类胡萝卜素分析方法、分析呈色组分,本研究基于高效液相色谱法检测果肉中类胡萝卜素组分,通过比较不同色泽果肉中类胡萝卜素物质差异,鉴定呈色组分。结果表明,用含0.01%BHT的正己烷∶丙酮∶无水乙醇(2∶1∶1,V/V/V)作为提取液,结合超声震荡、皂化脱脂等步骤,能有效提取菠萝蜜果肉中总类胡萝卜素。组分分析采用YMC carotenoid column C30(4.6×250 mm)色谱柱,二极管阵列检测器(photodiode array,PDA)在450 nm波长下,检测出16种不同的类胡萝卜素组分。定量结果表明,β-柠乌素是红色果肉的呈色组分,紫黄质是黄肉果肉主要的呈色组分。差异组分之间存在一定的代谢关联,即紫黄质合成前体的裂解反应及下游异构化反应是造成果肉色泽差异的潜在原因。     

菠萝蜜种质资源遗传多样性的SRAP分析

利用SRAP标记技术，对46份菠萝蜜种质资源进行遗传多样性研究。结果表明：20对SRAP引物组合共扩增出257条带，其中多态性条带194条，多态位点比率为75.5％，平均每对引物扩增条带数和多态性条带数分别为12.9条和9.7条。Shannon 遗传多样性指数I为0.365 7，Nei’s基因多样性指数H为0.241 4，表明供试样品遗传多样性不丰富。46份菠萝蜜种质间的遗传相似系数在0.674 8～0.975 5之间，平均为0.775 8，说明种质资源的亲缘关系较近。通过UPGMA构建树状图，当相似系数为0.771 0时，菠萝蜜种质资源可分为6个类群，我国的种质资源和东南亚来源的种质相对分开聚类，来源地相同或较近的种质表现出了较为亲密的亲缘关系。     

胡椒 PnNPR2 基因的克隆

基于胡椒转录组数据库,筛选胡椒病程相关基因非表达子基因的 EST 序列,设计引物,运用 RACE 法克隆得 到 1 个 NPR 基因,命名为 PnNPR2;该基因全长 2 260 bp,开放阅读框 1 722 bp,编码 573 个氨基酸;开放读码框含有 BTB/POT 结构域、ANK 锚蛋白重复序列、DUF 和 NPR1-like C 4 个结构域,具有植物 NPR1 所共有的保守结构域,并 将 PnNPR2 基因插入 pCAMBIA1300-35S-sGFP 超表达载体中。本研究结果为 PnNPR2 的功能研究奠定基础。     

胡椒PnNPR1基因的克隆与表达分析

根据胡椒病程相关基因非表达子1(Nonexpressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR方法获得其家族成员的1个全长c DNA,命名为Pn NPR1,长度1 712 bp,开放阅读框1 362 bp,编码454个氨基酸。预测Pn NPR1分子量为141.56 ku,理论等电点为4.98。该基因含有BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域,具有植物NPR1所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn NPR1与苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR结果表明,Pn NPR1在胡椒叶片、根、茎和花中均表达,在叶中的表达量最高。辣椒疫霉菌诱导后,Pn NPR1基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn NPR1的功能研究提供了理论依据。     

胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化

为研究胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化,以‘热引1号’胡椒外种皮经培养获得的非胚性愈伤组织（Y）、胚性愈伤组织（P）、胚性愈伤组织与体细胞胚混合物（H）、体细胞胚（T）与体细胞胚增殖（Z）5个时期样品为试验材料,采用LC-MS/MS技术检测不同时期胚性培养物的内源激素种类与含量,以期找出内源激素影响胡椒体细胞胚发生的关键因素。结果表明：在胡椒体细胞胚发生过程中,吲哚-3-乙酸（IAA）含量在H时期最高,在P时期最低,在H、T与Z时期逐渐降低。吲哚-3-丁酸（IBA）含量在Y时期最高,在P时期最低,在H、T与Z时期基本不变。吲哚-3-甲酸（ICA）含量在H时期最高,且只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。异戊烯腺嘌呤（IP）含量在H时期最高,在P时期最低,在T与Z时期接近于零。顺式玉米素（cZ）含量在Y时期最高,其他时期都接近于零。茉莉酸甲酯（ME-JA）含量只存在Y时期和P时期,但Y时期含量高于P时期。茉莉酸（JA）含量在Z时期最高,在P时期最低,在H、T与Z时期逐渐升高。水杨酸（SA）含量在H时期最高,在Y时期最低,且H、T与Z时期先降后升。脱落酸（ABA）含量在H时期最高,在P时期最低,在T与Z时期基本不变。赤霉素类（GA_S）主要存在于Y与P时期,H、T与Z时期含量很低。由此可见,IAA、SA与ABA可能与体细胞胚发生的相关性强,而cZ、MEJA与GA_S可能与愈伤组织产生相关性强。     

基于基因组和转录组数据的胡椒内参基因鉴定

为系统筛选适合胡椒基因表达模式分析的内参基因,本研究基于胡椒全基因组和转录组数据,初步筛选出62个候选基因。以胡椒主根、芽尖、叶片、花穗、不同发育时期果实以及接种辣椒疫霉菌的主蔓为材料,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件系统分析候选基因在不同组织中的表达稳定性,结合目标基因的表达模式验证,鉴定稳定表达最优的内参基因为Myeloid leukemia factor 1 (Pn17.1212)。结果表明：该基因是分析胡椒果实发育、辣椒疫霉菌响应相关基因表达模式的理想内参。内参基因的选择不应仅限于持家基因,全基因组和转录组信息可提供更加全面的参考基因数据,内参基因的准确鉴定需综合转录组信息、基因表达稳定性、标记基因的表达模式验证等数据分析的结果,获得的理想内参基因可满足不同研究对表达稳定性的要求。     

叶面喷施外源ABA对胡椒抗寒生理生化及ABA信号转导相关基因的影响

[目的]筛选出能提高胡椒抗寒性的脱落酸(ABA)适宜浓度,明确低温胁迫条件下外施适宜浓度ABA对胡椒叶片ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL表达的影响,为生产上提高胡椒抗寒技术及揭示ABA信号在胡椒抗寒中的作用机理提供依据.[方法]以热引1号胡椒为试验材料,通过叶面喷施0(CK)、25(T1)、50(T2)、75(T3)、100(T4)mg/L ABA及4℃低温胁迫处理,测定各处理胡椒叶片叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性(POD、CAT和SOD)、H2O2和MDA含量.在筛选出适宜ABA喷施浓度的基础上,进一步运用实时荧光定量PCR分析ABA信号转导相关基因的表达情况.[结果]低温胁迫后,不同浓度ABA处理的胡椒POD、CAT和SOD活性与CK相比均显著上升(P<0.05,下同),其中T2处理的POD活性升高最显著,T3处理的CAT和SOD活性升高最显著;随着ABA处理浓度的升高,H2O2和MDA含量呈先下降后上升的变化趋势,以T3处理含量最低,即一定浓度外源ABA处理对胡椒抗寒生理发挥积极作用.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo无显著变化;低温胁迫4d时,其Fv/Fm和Fv/Fo均显著降低,但T3处理缓解Fv/Fm和Fv/Fo下降效果显著,即ABA预处理能够在一定程度上缓解低温对胡椒光系统潜在活性的抑制.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理胡椒的qP和Yield无显著变化,但qN随着ABA处理浓度的升高明显下降,即正常生长条件下,外施不同浓度ABA对胡椒叶片的qP和Yield无影响,但会减弱胡椒的光保护能力;低温胁迫4 d时,不同ABA浓度处理的胡椒叶片qP、qN和Yield均有不同程度的下降,随着ABA处理浓度的升高,qN呈现下降、上升再下降的变化趋势,qP呈先下降后上升的变化趋势,T3处理成为转折点,即在低温胁迫下外源ABA能够提高胡椒的光保护能力,其中T3处理效果相对较好.低温胁迫条件下,ABA预处理可诱导ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL提前并高表达.[结论]外源ABA通过提高胡椒抗氧化酶活性、降低H2O2和MDA含量及缓解低温对其光系统活性的伤害,从而提高胡椒抵抗低温胁迫的能力.外源ABA还能诱导胡椒ABA信号转导相关基因表达,启动和引发植株固有抗冻性基因的表达,进而提高其耐冻性.