貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及其生物学特性

利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果显示,与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降;动物试验结果显示,htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建了貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

PCV2通过激活MyD88调控体外培养PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10

试验选取6头猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原、抗体均为阴性的30日龄断奶仔猪,无菌分离肺泡巨噬细胞(AMs),分4组进行体外培养:对照组、髓样分化因子88(MyD88)干扰组(干扰组)、PCV2感染组(PCV2组)、PCV2感染-MyD88干扰组(PCV2-干扰组)。采用小干扰RNA(siRNA)方法使MyD88基因沉默,并分别于培养后0、6、12、24和48h收集细胞及培养上清液。用荧光定量PCR法检测干扰效率,Western Blot方法检测细胞内MyD88蛋白的表达变化,ELISA方法检测培养上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的动态变化。结果显示,siRNA能使78%的MyD88基因沉默,并显著影响其蛋白表达;AMs中MyD88表达量,PCV2组从6h开始显著升高(P<0.05),PCV2-干扰组与PCV2组相比在12、24、48h差异极显著(P<0.01)。培养后各时间点,PCV2均能明显促进AMs分泌IL-1β(P<0.01或P<0.05),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-1β的分泌量均显著降低(P<0.05)。PCV2能显著增加感染后6和12hIL-6的分泌量(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-6的分泌量在6和12h显著降低(P<0.05)。PCV2明显促进感染后12、24和48hAMs分泌IL-10的能力(P<0.01),PCV2-干扰组和PCV2组相比,IL-10的含量在24和48h均极显著的降低(P<0.01)。结果表明,PCV2可引起体外培养的PAMs分泌IL-1β、IL-6和IL-10发生不同的变化,而MyD88是引起这些变化的重要调节因子。     

银杏叶提取物对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用研究

本试验旨在研究银杏叶提取物（Ginko biloba extract,GBE）对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用。取12日龄AA肉鸡心脏制备鸡原代心肌细胞,向原代心肌细胞培养板中分别加入0、5、10、50、100、150 mg/mL GBE,CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率;将原代心肌细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板,培养48 h,分别加入0、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/mL GBE,Hoechst 33258检测心肌细胞凋亡率,确定最适GBE浓度。42℃热应激处理（0、0.5、1、2和4 h）建立心肌细胞损伤模型,ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）、细胞丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量,以及超氧化物歧化酶（SOD）活性;Western blotting检测Hsp72蛋白表达。结果显示,高浓度GBE具有细胞毒性,50、100、150 mg/mL GBE能极显著抑制细胞生长（P<0.01）,50 μg/mL GBE能够极显著提高细胞增殖率（P<0.01）。热应激后细胞发生凋亡,细胞内MDA、LDH含量增加,SOD活性、GSH-Px含量减少,产生氧化损伤;GBE可以降低热应激时细胞LDH和MDA的含量,增加SOD活性和GSH-Px的含量,热应激2、4 h,GBE处理效果明显。此外,GBE可增加心肌细胞中Hsp72蛋白的表达。综上所述,GBE能降低热应激状态下心肌细胞的氧化损伤,其机制可能与提高抗氧化酶活性及提高Hsp72的表达有关。     

银杏叶提取物对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用研究

本试验旨在研究银杏叶提取物(Ginko biloba extract,GBE)对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用。取12日龄AA肉鸡心脏制备鸡原代心肌细胞,向原代心肌细胞培养板中分别加入0、5、10、50、100、150 mg/mL GBE,CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率;将原代心肌细胞以1×104个/孔接种于96孔板,培养48h,分别加入0、5、10、50、100、200、500、1 000μg/mL GBE,Hoechst 33258检测心肌细胞凋亡率,确定最适GBE浓度。42℃热应激处理(0、0.5、1、2和4h)建立心肌细胞损伤模型,ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、细胞丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blotting检测Hsp72蛋白表达。结果显示,高浓度GBE具有细胞毒性,50、100、150mg/mL GBE能极显著抑制细胞生长(P0.01),50μg/mL GBE能够极显著提高细胞增殖率(P0.01)。热应激后细胞发生凋亡,细胞内MDA、LDH含量增加,SOD活性、GSHPx含量减少,产生氧化损伤;GBE可以降低热应激时细胞LDH和MDA的含量,增加SOD活性和GSH-Px的含量,热应激2、4h,GBE处理效果明显。此外,GBE可增加心肌细胞中Hsp72蛋白的表达。综上所述,GBE能降低热应激状态下心肌细胞的氧化损伤,其机制可能与提高抗氧化酶活性及提高Hsp72的表达有关。     

应用型本科院校《动物病理学》课程教学改革探索与实践

以应用型人才培养的实施为切入点,构建产教融合、注重实践的动物病理学教学课程改革方案,利用"产学研"基地、新媒体辅助技术等手段,采取"以赛促学"、"双师同课"等方式,从课程目标、教学模式、教学方法、实践教学、考核评价方面进行探索和实践,为应用型地方本科院校动物医学专业课程改革提供参考。     

急性热应激对鸡呼吸系统损伤及肺脏热休克蛋白表达的影响

为探讨热应激对鸡肺脏组织损伤的影响,将60只35日龄SPF鸡随机分为对照组,热应激1、2、3、5、10 h组,每组10只,试验开始后环境温度迅速从25℃升高到35℃,观察热应激组鸡临床症状,热应激结束迅速剖杀、取病料,检测血清pH值、乳酸脱氢酶(LDH)、钾离子和钙离子浓度,石蜡切片检测肺脏组织结构,Western blot检测肺脏组织中热休克蛋白(HSPs)表达量。结果显示:与对照组相比,热应激组血清pH值显著升高(P<0.05),LDH水平均极显著升高(P<0.01),随着热应激时间增加,血钾和血钙浓度开始降低,热应激5、10 h后血钾和血钙浓度显著减低(P<0.05);病理组织学结果显示热应激后,肺组织内血管充血,肺房结构基本完整,热应激5 h后肺房内有大量的红细胞存在,热应激10 h肺房内的异物减少,但肺上皮细胞大量脱落,组织结构损伤严重;Western blot结果显示与对照组相比,HSP27和HSP72表达量极显著升高(P<0.01)HSP60表达量在热应激1 h后显著升高(P<0.05),随后呈降低的趋势,HSP90表达量在热应激5 h后显著升高(P<0.05),随后呈降低的趋势,HSC70表达量无明显变化。热应激可对鸡呼吸系统造成损伤,提高肺脏HSPs表达量。     

外泌体介导PCV2通过Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信号通路诱导淋巴细胞分泌IL-10

以接种PCV2的PK-15细胞所分泌的外泌体(P-Exo)孵育的脾脏淋巴细胞为研究对象,采用Western blot、间接免疫荧光、ELISA和qPCR等方法,分析外泌体对脾脏淋巴细胞IL-10分泌的影响及其信号通路。结果显示,P-Exo呈杯状,平均直径为50~150 nm,表达标志蛋白CD81和TSG101,包含PCV2 Cap蛋白;P-Exo孵育淋巴细胞后在细胞浆内观察到Cap蛋白;与PCV2组相比,P-Exo组IL-10含量显著升高(P<0.05),P-Exo lysis组和P-Exo BAY组则无明显变化;与对照组相比,P-Exo组淋巴细胞Toll7、Toll8和Toll9 mRNA表达量极显著升高(P<0.01),Toll3 mRNA表达量显著升高(P<0.05),Toll2和Toll4 mRNA表达量无明显变化;P-Exo能够显著升高淋巴细胞胞浆MyD88和p-IκBα蛋白含量,降低胞浆NF-κB/p65的含量,促进NF-κB/p65入核。结果表明,PCV2通过外泌体感染淋巴细胞,激活Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信号通路促进淋巴细胞分泌IL-10。     

鸡白痢沙门菌htrA基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为研究丝氨酸蛋白酶HtrA对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了鸡白痢沙门菌(ATCC19945) htra基因缺失突变株(ATCC19945Δhtra),通过测定其巨噬细胞内存活能力、应激条件实验,探究Htr A蛋白在鸡白痢沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株ATCC19945Δhtra与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其巨噬细胞内存活能力显著降低。应激环境试验结果表明,htra基因缺失后鸡白痢沙门菌对pH、热和H_2O_2氧化应激的敏感性增加,在蛋清中生存能力下降,生物被膜形成能力显著下降。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门菌的胞内存活机制、疫苗开发奠定基础。