苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从苏云金芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为89%～97%。将该基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展

概括了CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理,分析了该系统的不足,重点阐述了该技术在林木基因组编辑中的应用,并对CRISPR/Cas9系统的未来研究趋势进行了展望。     

我国水稻航天诱变育种的研究动态及展望

水稻航天诱变育种是将水稻干种子搭载返回式航天器(卫星),经过空间诱变作用产生变异,在地面选择有益变异培育新种质、新品种的育种方法。与常规育种相比,航天诱变育种具有诱变频率高、变异幅度大、育种周期短、有利突变体多等特点。目前普遍认同产生变异的主要因素有微重力、强幅射、转座子活化和高真空等,并从分子生物学、生物化学水平以及细胞学水平开展空间诱变机理研究,取得了可喜进展。我国自1988年首次通过卫星搭载开展水稻航天诱变育种以来,已有9个育成品种通过了省级审定,其中“华航一号”等4个品种通过了国家级审定。鉴于水稻航天诱变育种技术具有的独特优势,其可望成为推动21世纪水稻育种的重要手段之一。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

aiiA基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细菌的AHLs信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。转aiiA基因尾巨桉抗性检测结果表明,转基因植株抗性明显增强,表现为发病时间延迟,病情指数降低,评价为中等抗病水平。【结论】成功构建了aiiA基因原核表达载体,其诱导表达产物能猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。     

杂环脲类细胞分裂素诱导荔枝单性结实的试验研究

【目的】试验探索无单性结实能力和自然单性结实的荔枝品种在杂环脲类细胞分裂素诱导下产生单性结实果和异常果的可能性，【方法】应用研制的杂环脲类细胞分裂素2 mg/L，对廉江良垌镇果园无单性结实的桂味、广良红、妃子笑和单性结实的海南无核荔枝在花期喷施果穗，10-15 d再喷施1次，果实成熟取单性结实果、异常果和正常果样品测定并进行分析。【结果】花期应用杂环脲类细胞分裂素，使无单性结实能力的桂味、广良红、妃子笑和单性结实的海南无核品种荔枝诱导产生无核的单性结实果和异常果，但单性结实和异常果的果实比正常果实小，桂味、广良红、妃子笑单性结实果和海南无核异常果比正常果的平均单果重分别降低112.2%、29.5%、93.1%和79.3%；桂味、广良红荔枝单性结实果的可溶性固形物比正常果高，而妃子笑单性结实果和海南无核果的可溶性固形物比正常果低。【结论】试验说明杂环脲类细胞分裂素可以激发某些无单性结实能力的荔枝品种的单性结实潜能，无单性结实能力的荔枝可通过化学诱导产生单性结实果。     

转TSRF1基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性

以尾叶桉U6无性系无菌种子苗下胚轴为外植体,通过对不同生长调节剂的优化组合,建立尾叶桉高效再生体系.应用正交试验设计,优化尾叶桉遗传转化体系.经PCR和Southern杂交检测表明,TSRFI基因已整合到尾叶桉基因组中;转基因植株灌根接种青枯菌后,转基因植株表现出发病延迟,抗性提高,抗性相关酶活性显著增强.转化植株离体叶片对疫霉菌抗性明显增强.荧光定量PCR的结果表明转基因植株接种致病菌后TSRF1基因表达量得到提高.研究结果表明,转TSRF1基因尾叶桉表现出一定的广谱抗病能力.     

粗皮桉的组织培养与植株再生研究

[目的]研究不同植物生长调节剂组合对粗皮桉茎段愈伤组织诱导及再生的影响,为建立粗皮桉再生体系和粗皮桉商品化育苗提供参考.[方法]以粗皮桉茎段为外殖体,通过对不同植物生长调节剂组合的优化,建立粗皮桉再生体系.[结果]在MS培养基上添加2.0 mg/L PBU和0.05 mg/L IAA,21d后,外植体愈伤组织诱导率达98.4％;将愈伤组织接种在添加0.8 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的1/2MS培养基上,诱芽率高达86.0％;用1/2MS培养基添加0.8 mg/LPBU与0.1 mg/L NAA诱导粗皮桉不定芽增殖,用1/2MS培养基附加0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA诱导生根,炼苗15d后,组培苗移栽到黄心土与腐殖质土质量比为1∶1的基质中,成活率高达95.0％.[结论]2.0 mg/L PBU和0.05 mg/L IAA是诱导粗皮桉愈伤组织的最适植物生长调节剂组合,添加0.8 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的1/2MS培养基诱芽效果最好,添加0.1 mg/L NAA 、0.8 mg/L PBU组合时,芽增殖、生长情况较好,添加0.5 mg/L NAA 、0.5 mg/L IBA组合时生根效果最佳.     

3种抗生素对尾巨桉愈伤组织诱导及植株再生的影响

【目的】研究潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对尾巨桉愈伤组织诱导、不定芽分化及生根的影响,确立抑制农杆菌生长的头孢霉素质量浓度。【方法】以尾巨桉无菌苗茎段为外植体,先后接种于添加不同质量浓度抗生素的愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导培养基以及生根培养基上,统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定芽生根率,观察头孢霉素对农杆菌生长的影响。【结果】(1)培养基中的潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,200 mg/L时,尾巨桉外植体的愈伤组织诱导率分别为6.7%,12.1%和26.7%;(2)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽分化受到明显抑制,不定芽诱导率分别仅有2.6%,10.2%和7.6%;(3)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽生根困难,生根率分别为10.2%,16.2%和10.1%;当头孢霉素质量浓度≥200 mg/L时,农杆菌生长被完全抑制。【结论】尾巨桉对不同抗生素的敏感性存在差异,在尾巨桉遗传转化过程中,抗性愈伤组织与不定芽诱导的潮霉素适宜质量浓度为10 mg/L,卡那霉素为20 mg/L;生根诱导适宜的潮霉素和卡那霉素的质量浓度分别为15 和25 mg/L;抑制农杆菌生长的头孢霉素较适宜的质量浓度为200 mg/L。     

植物病原菌群体猝灭基因克隆及诱导表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。研究利用PCR方法从枯草芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明,该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为87%～96%。将该基因置于诱导型启动子PPP3调控下,连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物诱导表达载体pCAM-PPP3-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。