禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FADV-4)的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白(Hexon)基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。     

鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】 制备鸡环指蛋白165（RNF165）多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】 以鸡胚成纤维细胞（DF-1）为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF165基因,将其连接至pET-28a （+）质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】 成功扩增得到大小为1 068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的RNF165蛋白,效价为1：32 000。生物信息学分析结果显示,RNF165蛋白由350个氨基酸组成,分子质量为39.88 ku,等电点为7.13,不稳定指数为69.87,为亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,有29个磷酸化位点;RNF165蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成;RNF165出现在细胞核内的概率最高,为47.8%;RNF165蛋白质C-端296―341位氨基酸残基为RING-Ubox超家族保守结构域。【结论】 本研究所制备的鼠抗RNF165多抗隆抗体具有较高的反应性和特异性,RNF165蛋白为亲水性蛋白,主要在细胞核内表达,结果可为研究RNF165蛋白的生物学功能提供材料支持。     

REV囊膜蛋白的原核表达、抗体制备及鉴定

[目的]禽网状内皮增生症病毒(reticuloendothelial virus,REV)囊膜蛋白与细胞表面受体结合启动病毒感染,并在REV的复制、致病过程中具有重要作用.为探索REV囊膜蛋白相关生物学特性,研究获得了高效表达的禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白,制备多克隆抗体.[方法]利用原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1表达REV囊膜蛋白gp90,并通过Ni2+亲和层析柱对融合蛋白REV-His-gp90进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了多克隆抗体;纯化的REV-GST-gp90蛋白用于检测多克隆抗体效价.[结果]pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90表达质粒构建成功,通过SDS-PAGE验证蛋白能在大肠杆菌BL21菌株中表达;Western-blot检测结果显示制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;采用间接ELISA法检测抗血清效价为1:64000;IFA结果显示,制备的多克隆血清能与REV特异性反应.[结论]研究制备的多克隆抗体效价高、特异性良好,为进一步开展REV囊膜蛋白的生物学特性研究及其特异性抗体应用奠定基础.     

一例牛泰勒焦虫病的诊断与分析

牛泰勒焦虫病（theileriasis of cattle）是由泰勒科泰勒属的各种原虫寄生于牛红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞内引起的一种寄生性血液原虫病[1],以高热稽留、贫血、消瘦、体表淋巴结肿大为特征。该病发生有明显的季节性,传染性强、死亡率高,使养牛业遭受严重损失。2013年6月份湖北省某个体养牛场患病肉牛,经流行病学调查、临床诊断、血液涂片检查、PCR检测等方法,确诊为泰勒焦虫感染。     

雏鸡禽脑脊髓炎继发魏氏梭菌感染

湖北荆州某种鸡场孵化的2批雏鸡均在11日龄左右发病,其临床主要表现为头颈震颤、共济失调、跛脚等神经症状;解剖及病理组织学观察可见主要病变在于脑部,眼观脑组织稀软如泥,病理切片可见脑组织中毛细血管充血,神经元变性、坏死,出现中央染色质溶解现象;部分小血管周围出现淋巴细胞浸润形成的管套现象;变性细胞周围出现卫星现象及噬神经元等典型的禽脑脊髓炎病理变化。禽脑脊髓炎免疫琼扩试验被检血清于24 h后出现明显沉淀线,进一步确诊该病例为禽脑脊髓炎。同时,通过细菌分离、染色及生化"爆乳"试验,确认该病例雏鸡继发魏氏梭菌感染。     

猪链球菌2型昆明鼠动物病理模型的建立

为研究猪链球菌2型的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,选用20~25 g健康昆明鼠,以猪链球菌2型山东株为病原,以腹腔注射为感染途径,对猪链球菌2型昆明鼠病理模型进行了探讨(试验随机分为5组,每组10只)。结果表明,感染鼠能表现出典型的临床症状及病理变化,具有较好的重复性,且临床症状及病理变化与本动物猪类似。剖检后从脑、肺,以及胸腔、腹腔和心包积液中都可以分离出猪链球菌2型,分离菌株生物学特性与攻毒菌株一致。按Reed-Munch法计算此菌株对昆明鼠的半数致死量为7×108cfu。感染后2周的血清平均抗体水平为1∶64。这说明昆明鼠能够很好地用作猪链球菌2型的动物病理模型。     

单增李斯特菌双元调控系统lmo1060/lmo1061缺失株的构建及其抗酸应激能力

为了探明双元调控系统Lmo1060/Lmo1061是否影响单增李斯特菌(LM)的抗应激作用及致病性,本研究以LM 10403S为亲本株,通过同源重组技术构建了 Δlmo1060/lmo1061缺失株.应激存活试验结果表明,lmo1060/lmo1061缺失显著增强LM在酸应激(pH=2.5)条件下的存活率,但不影响该菌...     

致蛋鸡髓细胞瘤型ALV-A病毒株的分离与鉴定

正禽白血病是由禽白血病病毒引起的严重危害我国养鸡业的重要肿瘤性疾病。不同亚群的禽白血病病毒可以引起鸡淋巴细胞瘤、髓细胞瘤、血管瘤、成红细胞瘤等多种类型肿瘤发生,A、B亚群主要引起鸡经典的淋巴细胞瘤,J亚群禽白血病病毒主要引起髓细胞瘤、血管瘤为主的肿瘤~([1])。过去十几年给我国养鸡业造成了巨大威胁,而其他亚群的禽白血病病毒引起病例报道较少。近年来,随着各种外在条件的变化,禽白血病病毒不同毒株和不同亚群之间交叉重组时有发生,     

鸡单核细胞增生性李斯特菌病诊断与病原鉴定

通过临床观察、病理剖检、细菌学检测、生化试验、动物试验及低温培养试验,确诊一例鸡李斯特菌病,并鉴定一株鸡源单核细胞增生性李斯特菌,药敏试验结果表明该分离菌对氯霉素敏感性最高。     

两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5'-端长末端重复序列(5'-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5'-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重 PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5'-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5'-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。