非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

[目的]制备橡胶延长因子重组蛋白及其多克隆抗体。[方法]用RT-PCR法扩增橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)编码区基因,将其克隆到原核表达载体pDEST17中,转化大肠杆菌BL21-AI,用L-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达,并采用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA和W estern blot对抗体效价和特异性进行鉴定。[结果]高效表达和纯化了橡胶延长因子重组蛋白,用其免疫家小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗体,W estern blot检测显示该抗体可识别胶乳中的天然橡胶延长因子。[结论]成功获得橡胶延长因子重组蛋白,制备了效价高、特异性好的鼠抗橡胶延长因子抗体,为进一步橡胶延长因子及其他橡胶粒子膜蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。     

尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)多克隆抗体,为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础.[方法]采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck,然后转入大肠杆菌B21(DH3)中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价.[结果]尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值(GRAVY)为-0.454,属于亲水性蛋白,具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,无典型的跨膜区.经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD,主要以包涵体形式存在.免疫日本大耳白兔后可获得效价为1:256000的Lck多克隆抗体,且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白.经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上,纯度约95%,抗体纯化效果良好.[结论]经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性,可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究.     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

猪TLR3胞外区片段重组载体的构建、表达和多克隆抗体的制备

为制备猪TLR3(poTLR3)胞外区蛋白的多克隆抗体,从poTLR3克隆载体扩增胞外区基因序列连接到pGEX-4T-1载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,表达GST-poTLR3融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,利用Western-blot和细胞免疫荧光验证抗体与真核表达蛋结合的白特异性.结果表明:制备的多克隆抗体的效价可达1∶128 000,poTLR3胞外区蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并且制备的多克隆抗体特异性好、滴度高.     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。