鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】 制备鸡环指蛋白165（RNF165）多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】 以鸡胚成纤维细胞（DF-1）为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF165基因,将其连接至pET-28a （+）质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】 成功扩增得到大小为1 068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的RNF165蛋白,效价为1：32 000。生物信息学分析结果显示,RNF165蛋白由350个氨基酸组成,分子质量为39.88 ku,等电点为7.13,不稳定指数为69.87,为亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,有29个磷酸化位点;RNF165蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成;RNF165出现在细胞核内的概率最高,为47.8%;RNF165蛋白质C-端296―341位氨基酸残基为RING-Ubox超家族保守结构域。【结论】 本研究所制备的鼠抗RNF165多抗隆抗体具有较高的反应性和特异性,RNF165蛋白为亲水性蛋白,主要在细胞核内表达,结果可为研究RNF165蛋白的生物学功能提供材料支持。     

不同环境温度下普通小麦-野生二粒小麦染色体臂置换系的农艺性状差异分析

以普通小麦品种中国春(chinese spring,简称CS)为遗传背景的野生二粒小麦染色体臂置换系(chromosome arm substitution lines,简称CASLs)为材料,在小麦全生育期内利用大棚模拟气温升高,以大田栽培环境为对照,研究温度升高对不同置换系穗部和籽粒性状形成的影响。结果表明:在2个生长环境对比下,各置换系材料的性状均有不同变化,材料间存在着显著的差异。各置换系的籽粒性状对温度的敏感性不同,粒长和千粒质量受大棚环境的影响较大,以2BS和4AL置换系的千粒质量增幅最大,分别为23.9%、30.6%;对于穗部性状,各置换系穗长和小穗数受温度的影响变化较大,所以小穗密度也呈现出较大的变化幅度,其中2BS置换系的增幅最大,高达42.5%,1AL置换系次之,为15.0%。因此可见不同置换系材料的籽粒和穗部性状对不同环境温度的敏感性不同。     

单增李斯特菌双元调控系统lmo1060/lmo1061缺失株的构建及其抗酸应激能力

为了探明双元调控系统Lmo1060/Lmo1061是否影响单增李斯特菌(LM)的抗应激作用及致病性,本研究以LM 10403S为亲本株,通过同源重组技术构建了 Δlmo1060/lmo1061缺失株.应激存活试验结果表明,lmo1060/lmo1061缺失显著增强LM在酸应激(pH=2.5)条件下的存活率,但不影响该菌...     

REV囊膜蛋白的原核表达、抗体制备及鉴定

[目的]禽网状内皮增生症病毒(reticuloendothelial virus,REV)囊膜蛋白与细胞表面受体结合启动病毒感染,并在REV的复制、致病过程中具有重要作用.为探索REV囊膜蛋白相关生物学特性,研究获得了高效表达的禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白,制备多克隆抗体.[方法]利用原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1表达REV囊膜蛋白gp90,并通过Ni2+亲和层析柱对融合蛋白REV-His-gp90进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了多克隆抗体;纯化的REV-GST-gp90蛋白用于检测多克隆抗体效价.[结果]pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90表达质粒构建成功,通过SDS-PAGE验证蛋白能在大肠杆菌BL21菌株中表达;Western-blot检测结果显示制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;采用间接ELISA法检测抗血清效价为1:64000;IFA结果显示,制备的多克隆血清能与REV特异性反应.[结论]研究制备的多克隆抗体效价高、特异性良好,为进一步开展REV囊膜蛋白的生物学特性研究及其特异性抗体应用奠定基础.     

秀水134为背景的染色体片段代换系的构建

染色体片段代换系作为发掘和鉴定有利基因的有力工具得到了广泛的应用。本研究以秀水134为背景亲本,以扬稻6号为供体亲本,构建了一套染色体片段代换系。该代换系包含53个株系,其代换片段长度在7.4～182.15 cM之间,占水稻全基因组的0.49%～12.15%,平均占水稻全基因组的5.0%。这套代换系的代换片段总长度为1 995 cM,覆盖水稻基因组的1.33倍。本文还对染色体片段代换系的构建策略和应用进行了讨论。     

热胁迫下水稻miR396家族及靶基因OsGRFs的表达研究

miRNA是真核生物体内一类非编码的小RNA,在动植物发育过程中发挥重要作用,但迄今为止,其在水稻耐高温方面的分子机理研究很少。为进行水稻(Oryza sativa)高温胁迫下miRNA的功能研究,前期通过小RNA测序发现,miR396家族是响应水稻高温胁迫最显著的家族。为了进一步研究miR396家族响应高温胁迫的分子机制,本研究对水稻日本晴(Oryza sativa spp.japonica cv.Nipponbare)苗期叶片进行不同时间48℃高温处理,通过q RT-PCR法分析8个miR396家族成员以及12个预测的靶基因生长调节因子(growth regulating factor,GRF)家族的表达情况。结果显示,miR396家族8个成员及12个预测靶基因对高温胁迫应答不同。miR396a、miR396e和miR396f在每个时间的高温胁迫呈上升表达,而miR396b,miR396c,miR396d,miR396g,miR396h在1.5、3、6 h呈下降表达,在12、24 h呈不同程度上升表达;miR396a、miR396e和miR396f在高温胁迫下上升表达10倍以上,其中miR396f上升100倍以上。Os GRF家族随高温胁迫呈不规律的上升或下降表达,其中Os GRF2随着胁迫时间增加持续下降表达至8~10倍。并且Os GRF2与miR396a、miR396e和miR396f的表达呈高的负相关,表明Os GRF2为miR396a、miR396e和miR396f的靶基因。研究结果表明miR396在水稻耐高温方面有关键作用。     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

单核细胞增生李斯特菌SigB调控GadD3的抗酸应激作用

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性人兽共患病病原菌,其拥有一系列抗酸应激系统以抵抗酸应激的伤害作用。谷氨酸脱羧酶(GAD)系统是该菌抗酸应激系统重要成员之一,酸应激存活试验表明,GAD系统3个谷氨酸脱羧酶基因对单增李斯特菌抗酸应激能力的贡献依次为gadD2、gadD3和gadD1。为阐明GAD系统抗酸作用调控机制,通过荧光定量PCR、GFP报告基因和免疫印迹结合酸应激存活试验,证实了应激调控因子SigB参与正调控gadD3的转录与表达,但是不影响gadD1和gadD2的表达,进而通过gadD3参与单增李斯特菌的抗酸应激作用。研究结果丰富了单增李斯特菌抗酸应激系统的调控网络,并可为李斯特菌病的防控提供理论依据。     

试管苗温室移植成活率主要因素的研究

试管苗温室移植成活率主要因素的研究张雅君，徐妙珍，张方春，鞠新和，赵同林（黑龙江省林科所）（黑龙江省方正林业局）于英华，祝长义（黑龙江省山河屯林业局）（哈尔滨市林业局）为了扩大黑龙江省杨树丰产林的营造面积，１９９１年我们引进了欧洲山杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ...