草鱼乙酰辅酶A羧化酶β基因全长cDNA分子克隆与表达分析

本试验采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得草鱼乙酰辅酶A羧化酶β(ACC2)基因全长c DNA,并采用实时荧光定量PCR技术研究ACC2基因在肝胰脏、脾脏、大脑、前肠、中肠、后肠、肾脏、肌肉、心脏和肠系膜脂肪等组织中的表达,同时,还对饲喂不同脂肪源饲料12周后草鱼肝胰脏和肌肉中以及饥饿再次投喂后3、6、12和24 h肝胰脏中ACC2 mRNA的表达变化进行了研究。结果显示:草鱼ACC2基因c DNA全长7 533 bp,含1个7 149 bp的开放阅读框,编码2 382个氨基酸,ACC2蛋白计算分子质量为268.34 ku,等电点为6.13。草鱼ACC2基因存在可变剪接,形成另外1个同工型(isoforms),比分子质量为268.34 ku的ACC2蛋白少8个氨基酸。ACC2基因在所有检测组织中均有表达,ACC2 mRNA的相对表达量在肌肉中最高,为29.13,在肝胰脏中最低,仅为1.90。肌肉中ACC2 mRNA的相对表达量与大脑、前肠和心脏差异不显著(P0.05),但显著高于其他组织(P0.05)。投喂不同脂肪源饲料对草鱼肝胰脏及肌肉中ACC2 mRNA相对表达量无显著影响(P0.05);饥饿再投喂后草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA相对表达量在12 h达到高峰值,为6.17,之后明显下降,24 h时仅为2.84。本试验成功克隆了草鱼ACC2基因全长c DNA,其主要的功能位点ATP结合位点、生物素结合位点与其他脊椎动物相比基本保守。草鱼ACC2基因主要在肌肉等脂肪分解活跃的组织中表达,投喂不同脂肪源饲料对草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量无显著影响;饥饿再投喂后,肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量在投喂12 h后最高。     

日粮中血粉替代鱼粉对草鱼生长和肌肉氨基酸组成的影响

试验旨在研究血粉替代部分鱼粉对草鱼生长及肌肉营养成分的影响。以含鱼粉12%日粮为对照组,以血粉分别替代对照组饲料中25%、50%和75%的鱼粉,配制3种试验饲料,投喂平均体质量194.0 g的草鱼64 d。结果表明,各试验组草鱼摄食量下降,增重率显著低于对照组(P<0.05),但25%血粉替代组草鱼饲料系数、肝体比、脏体比、肌肉粗脂肪的含量与对照组无显著性差异(P>0.05),而50%和75%血粉替代组的饲料系数、肌肉粗脂肪明显升高;与对照组相比较,各血粉替代组的粗蛋白含量、粗灰分含量、必需氨基酸总量和鲜味氨基酸总量均无显著性差异(P>0.05)。综合分析表明,血粉代替草鱼日粮中鱼粉的量为25%时,可以获得较好的效果。     

草鱼脂酰辅酶A合成酶4基因全长cDNA分子克隆及表达调控

本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂0、3、6、12和24 h后草鱼肝胰脏中ACSL4基因表达情况进行研究。结果显示:草鱼ACSL4基因cDNA全长2 418 bp,其开放阅读框2 121 bp,共编码706个氨基酸;草鱼ACSL4蛋白的氨基酸序列包含1个跨膜结构域、1个脂肪酸绑定基序和1个ATP/AMP绑定基序。草鱼ACSL4 mRNA在大脑和脾脏中相对表达量较高,显著高于其他组织(P <0.05),在肌肉中相对表达量最低;投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05);饥饿再投喂12 h后,草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量达到最高值,显著高于其他时间段(P<0.05),24 h后恢复至最初水平。本试验从草鱼10种混合组织中克隆了ACSL4基因全长cDNA,其所编码的氨基酸序列的主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ATP/AMP绑定基序在不同物种间高度保守;草鱼ACSL4基因主要在大脑和脾脏中表达;饲料中淀粉源对草鱼肝胰脏中ACSL4基因的表达无显著影响;在饥饿再投喂12 h后,草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量达到最高值,随后显著下降至最初水平。     

鱼类趋化因子家族的研究进展

趋化因子(chemokines)是一类分子量仅 8~10 kD 的小分子细胞因子,由巨噬细胞、成纤维细胞、T 细胞和 B 细胞等表达分泌。按生理功能的差异可将趋化因子分为组成型和诱导型,前者通常参与淋巴细胞的迁移、定位以及免疫监视, 而后者仅在感染或炎性刺激时分泌并诱导白细胞迁移至炎症部位。根据氨基酸序列中前两个半胱氨酸(Cys)的排列方式, 可以将趋化因子分为 4 类: CXC 亚族、CC 亚族、C 亚族和 CX3C 亚族。鱼类至今尚未发现有关 CX3C 亚族趋化因子的研究报道, 但拥有一类特有的 CX 亚族。除了基本的募集和激活白细胞功能外, 鱼类趋化因子在免疫应答、应激反应、胚胎发育及血管生成等方面也发挥着重要作用。本文从鱼类趋化因子及其受体的分类、鉴定、结构、表达以及功能等方面进行了综述。     

团头鲂NK-lysin基因鉴定和表达分析

为研究抗菌肽NK-LYSIN在团头鲂免疫系统中的可能功能,本实验从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb),通过PCR扩增并测序验证其ORF序列。通过荧光定量PCR检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达,并构建其原核表达体系。结果显示,团头鲂nkla和nklb分别编码122和136个氨基酸,NKLA和NKLB均属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员,各含有6个高度保守的半胱氨酸及1个Sap B结构域。在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,在肌肉和血液中表达量极低;而nklb则在肠中表达量较高,在头肾中表达量较低,在其他组织均有表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示它们可能存在功能上的分化。经嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla与nklb表达变化模式相似,头肾中,表达量在4 h时显著下降;肝脏中,表达量在4 h达到最高,而后回落到正常水平;在脾脏和肠中4 h时开始下降,72 h时达到峰值,暗示NK-lysin可能在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥重要作用。另外,本实验对nkla和nklb进行了原核表达,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。     

团头鲂白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及活性分析

为了解鱼类白细胞介素6(IL-6)基因的转录调控原理及其免疫作用机制,构建5个团头鲂il-6基因启动子的荧光素酶报告质粒(PGL3-IL-6P),以PGL3-basic质粒作为阴性对照,将它们分别与内参质粒pRL-TK共转染进鲤EPC细胞,并用100ng/mL的LPS诱导转染过重组载体的细胞,24h后检测荧光素酶的活性。结果显示:与阴性对照组相比,质粒转染组PGL3-IL-6P-0、PGL3-IL-6P-1、PGL3-IL-6P-2、PGL3-IL-6P-3与PGL3-IL-6P-4的荧光素酶活性均明显升高,其中PGL3-IL-6P-4组的荧光素酶活性最高,表明该启动子缺失体(-379至+34)包含il-6的核心启动子。用LPS刺激转染过重组载体的细胞后发现,与未经LPS刺激的对照组相比,仅PGL3-IL-6P-4组的活性明显增强,而其余缺失体的活性则没有显著变化,这进一步表明PGL3-IL-6P-4缺失体包含核心启动子区,并推测该核心启动子区域存在的潜在转录因子NF-κB与C/EBPβ等可能是响应LPS刺激的重要作用元件。     

SPME-GC-MS联用法测定鲤和草鱼肌肉挥发性腥味物质的条件优化

以鲤和草鱼为研究对象,采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用的方法分离鉴定了其背肌挥发性腥味物质。本实验优化了顶空固相微萃取的操作条件,并对比了鲤和草鱼挥发性腥味物质的差异。结果表明最佳萃取条件为：15 m L顶空瓶中加入3 g鱼肉和3 m L饱和Na Cl溶液(0.36 g/m L),萃取温度为60℃,萃取时间为40 min,解析时间为5 min。采用上述方法从两种鱼肉中萃取出35种挥发性腥味物质,对比分析发现鲤肌肉中挥发性腥味物质的含量高于草鱼肌肉。     

日粮中添加晶体赖氨酸、蛋氨酸对鲤鱼生长及生理生化指标的影响

试验探究配合饲料中晶体赖氨酸、蛋氨酸对鲤鱼生长及生理生化指标的影响。设计4组饲料,对照组不添加晶体氨基酸,3个试验组分别添加0.45%赖氨酸、0.15%蛋氨酸、0.45%赖氨酸+0.15%蛋氨酸,投喂平均体重27.0 g鲤鱼,养殖周期为8周。结果显示,各试验组和对照组在生长指标和营养指标上均无显著性差异。分析血液中不同时间段的氨基酸浓度,发现晶体氨基酸和饲料氨基酸吸收有明显的不同步现象。肌肉中的氨基酸含量显示4组间差异显著。综合分析,饲料中添加晶体赖氨酸、蛋氨酸对鲤鱼的生长没有影响,其主要原因是氨基酸吸收不同步导致的。     

团头鲂Dmrt4基因的克隆与表达分析

为研究团头鲂Dmrt4基因的可能作用,采用RACE-PCR技术克隆了团头鲂卵巢Dmrt4基因的cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术对其胚胎及出膜后30 d内各期、成鱼不同组织、雌雄性腺各分期的表达进行研究。结果表明,团头鲂Dmrt4基因至少存在2种不同的剪接形式,分别命名为Dmrt4a 和Dmrt4b。其中,Dmrt4a cDNA全长1 265 bp,编码352个氨基酸,含DM和DMA 2个结构域;Dmrt4b cDNA全长1 081 bp,编码281个氨基酸,仅含DMA结构域。氨基酸序列同源性分析显示,团头鲂Dmrt4与牙鲆、奥利亚罗非鱼的同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明,Dmrt4基因在团头鲂胚胎期至出膜后30 d内均有表达,且在受精后32 h的表达量最高;成鱼卵巢的表达量显著高于其他组织（P<0.01）;Ⅱ期卵巢的表达量显著高于其他时期,也显著高于精巢各分期（P<0.01）。上述结果表明,Dmrt4基因可能对团头鲂卵母细胞初期的生长起到重要作用,在雌鱼性腺发育过程中亦发挥一定的作用。     

鱼类巨噬细胞标记物的研究进展

<正>鱼类的免疫系统由非特异性免疫和特异性免疫组成,包括免疫组织和器官、免疫细胞及免疫因子等。鱼类免疫细胞主要有两种类型:一类是淋巴细胞,主要参与特异性免疫应答;另一类是吞噬细胞,作为非特异性和特异性免疫系统的重要组成部分,在抵御病原体侵袭方面发挥着非常重要的作用。