UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

[目的]本文旨在建立土壤中多种植物激素的提取及超高效液相色谱串联质谱法,并用此方法同时测定土壤中茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素,玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯、脱落酸、赤霉素、水杨酸共19种植物激素含量。[方法]以根标土壤为试验材料,采用异丙醇水甲酸(80∶19∶1,V/V/V)作为提取剂,经过超声、离心后得到植物激素提取液,提取液于常温条件下真空浓缩至干,采用甲醇进行复溶,得到植物激素待测液。采用Waters ACQUITYUPLC■HSST3色谱柱对19种植物激素进行分离,以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.01%甲酸)作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈(含0.01%甲酸)作为流动相B进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃;采用超高效液相色谱串联质谱,多反应监测离子模式进行定性定量分析,其中,茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素、玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯采用正离子模式扫描,脱落酸、赤霉素、水杨酸采用负离子模式扫描;采用外标法测定植物激素回收率。[结果]在本试验浓度范围内,上述19种植物激素浓度与对应峰面积的相关系数(r)均大于0.99,检出限介于0.02~1.06 ng/g之间,19种植物激素的加标回收率为70.2%~117%,相对标准偏差介于0.20%~7.3%之间。采用优化后的实验方法测定土壤中的植物激素,结果检测出吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸和独角金内酯5种植物激素,含量为0.55~5.79ng/g。[结论]本方法前处理不需要过夜浸提,加入二氯甲烷后,超声离心浓缩复溶后可直接进样检测,大大缩短了样品的前处理时间,超高效液相色谱串联质谱法操作简单,选择性好,灵敏度高,可实现土壤样品中多种植物激素的同时检测,为土壤中植物激素的深入研究提供了一种有效的研究方法。     

土壤性质对真菌温度敏感性的影响

通过伽马灭菌的方式,将两种不同性质的土壤(自然土和农田土)进行灭菌,再互相接种未灭菌土壤,研究了改变土壤性质对真菌温度敏感性的影响。结果表明,改变土壤性质虽显著影响真菌总丰度,但对真菌总丰度的温度敏感性无显著性影响。然而,部分土壤真菌个体(分类操作单元OTU)对温度具有敏感性,改变土壤性质会对温度敏感真菌个体产生影响。首先,改变土壤性质使自然土壤真菌中的热响应真菌目的个数由2减少为1,使农田土壤真菌中的冷响应真菌目的个数由5增加到9;其次,升温使自然土壤的真菌在自然土壤中冷响应和热响应真菌累积相对丰度之和从2.22%减少为1.35%,在农田土壤中从1.25%减少为0.56%;升温使农田土壤的真菌在农田土壤中冷响应和热响应真菌累积相对丰度之和从13.66%增加到19.03%,在自然土壤中从6.01%减少为2.51%;再次,改变土壤性质使自然土壤的热响应真菌由Capnodiales、Chaetothyriales变为Eurotiales,农田土壤的热响应真菌由Capnodiales、Sordariales变为Chaetothyriales、Hypocreales;自然土壤的冷响应真菌由Chaetosphaeriales、Sordariales等变为Capnodiales、Hypocreales等,农田土壤的冷响应真菌由Chaetothyriales、Eurotiales等变为Capnodiales、Sordariales等;最后,各真菌在目水平上的相对丰度变化率也各不相同。本研究表明,改变土壤性质可显著影响真菌群落结构的温度敏感性,进而可能改变真菌功能的温度敏感性。     

秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响

【目的】研究不同秸秆添加量对土壤固氮速率及固氮菌群落结构的影响,为我国秸秆还田及化肥减施增效提供支持。【方法】采用室内培养试验,除对照（C0: 0）外共设5个秸秆添加梯度（C1：0.2 mg·g^-1;C2：1.0 mg·g^-1;C3：2.0 mg·g^-1;C4：4.0 mg·g^-1;C5：10.0 mg·g^-1）,采用¹⁵N₂标记的方法,在黑暗条件下培养28 d后收集土壤样品,进而对生物固氮速率进行定量,利用Illumina PE250高通量测序和荧光定量PCR技术分析固氮功能基因nifH的丰度及群落特征。【结果】随着秸秆添加量的增加,土壤硝态氮含量显著下降,铵态氮含量无显著变化,土壤pH有下降趋势。同时,生物固氮速率显著增加,C3、C4及C5处理在培养期间（28 d）潜在固氮速率为87—96 kg N·hm^-2·a^-1,相比于对照提高了38.1%—52.4%。各处理固氮微生物nifH基因拷贝数变化范围为5.48×10⁷—9.20×10⁷ copies/（g soil）,其中,相比于C0,C4及C5处理固氮微生物nifH基因拷贝数均显著提高（P<0.05）。随着秸秆添加量的增加,C4、C5水平的香农-威尔指数显著低于其他4个处理（P<0.05）,其他4个处理多样性无显著差异。主成分分析（PCoA）结果显示土壤固氮微生物群落结构主要因秸秆添加量差异而聚集为不同组别。固氮微生物在门水平上分为变形杆菌（Proteobacteria）,蓝细菌（Cyanobacteria）,厚壁菌（Firmicutes）和放线菌（Actinobacteria）和螺旋体菌（Spirochaetes）。随着秸秆添加量的增加,蓝细菌相对丰度有先增加再降低的趋势;在属水平上,不同优势菌属对秸秆添加量的响应存在明显差异,慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）为数量最丰富菌属,随着秸秆添加量的增加,C5相较于C0、C1、C2、C3水平相对丰度差异显著（P<0.05）,显著增加了12.07%—14.13%。与生物固氮速率呈正相关的贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）随着秸秆添加量的增加其相对丰度逐渐增加,但当秸秆添加量达C5水平其相对丰度反而降低（P<0.05）。同时,最小偏二乘路径分析（PLS-PM）,冗余分析(RDA)及相关性分析表明生物固氮速率和土壤固氮微生物群落受秸秆添加量和NO₃^--N含量影响较大。【结论】土壤生物固氮速率随着秸秆添加量的增加而增加,秸秆对固氮的促进作用主要源于秸秆添加降低了土壤NO₃^--N含量,进而促进慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）和固氮螺菌属（Azospirillum）等固氮菌属微生物的生长。根据本试验结果计算,相比于不添加秸秆,添加秸秆4.0 mg·g^-1后,土壤生物固氮速率约增加26 kg N·hm^-2·a^-1,可显著降低我国氮肥需求。