UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

[目的]本文旨在建立土壤中多种植物激素的提取及超高效液相色谱串联质谱法,并用此方法同时测定土壤中茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素,玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯、脱落酸、赤霉素、水杨酸共19种植物激素含量。[方法]以根标土壤为试验材料,采用异丙醇水甲酸(80∶19∶1,V/V/V)作为提取剂,经过超声、离心后得到植物激素提取液,提取液于常温条件下真空浓缩至干,采用甲醇进行复溶,得到植物激素待测液。采用Waters ACQUITYUPLC■HSST3色谱柱对19种植物激素进行分离,以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.01%甲酸)作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈(含0.01%甲酸)作为流动相B进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃;采用超高效液相色谱串联质谱,多反应监测离子模式进行定性定量分析,其中,茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素、玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯采用正离子模式扫描,脱落酸、赤霉素、水杨酸采用负离子模式扫描;采用外标法测定植物激素回收率。[结果]在本试验浓度范围内,上述19种植物激素浓度与对应峰面积的相关系数(r)均大于0.99,检出限介于0.02~1.06 ng/g之间,19种植物激素的加标回收率为70.2%~117%,相对标准偏差介于0.20%~7.3%之间。采用优化后的实验方法测定土壤中的植物激素,结果检测出吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸和独角金内酯5种植物激素,含量为0.55~5.79ng/g。[结论]本方法前处理不需要过夜浸提,加入二氯甲烷后,超声离心浓缩复溶后可直接进样检测,大大缩短了样品的前处理时间,超高效液相色谱串联质谱法操作简单,选择性好,灵敏度高,可实现土壤样品中多种植物激素的同时检测,为土壤中植物激素的深入研究提供了一种有效的研究方法。     

水稻根系细菌挥发性有机物对小孢根霉的非接触性抑制作用

【目的】 通过分析水稻根系细菌挥发性有机物（volatile organic compounds,VOCs）组成和对小孢根霉（Rhizopus microsporus）的抑制作用,寻找新的具有潜在抑菌功能的挥发性物质。【方法】 通过对扣熏蒸法测定不同细菌对小孢根霉的抑菌率;采用顶空固相微萃取法收集细菌挥发性有机物,对其进行气相色谱-质谱（GC-MS）检测,测得细菌挥发性有机物质谱,并在NIST/EPA/NIH数据库中进行比对鉴定,根据抑菌效果及各物质在质谱中的峰面积,进行相关性分析,购买与抑菌率具有显著相关性的物质,体外检测这些纯物质对小孢根霉的抑制作用。【结果】 所有菌株均能释放挥发性有机物,并且通过挥发性有机物的非接触性产生不同的抑菌效果,这些菌株共产生14类90种挥发性有机物,分别为酯、烯烃、烷、酮、酸、噻吩、醛、萘、硫化物、酚、醇、吡嗪、吡咯和苯类物质,其中所有菌株都能够释放醇类物质。通过相关性分析,发现有6种物质具有潜在的抑菌活性,分别为2-庚酮、5-甲基-2-己酮、2-壬酮、5-甲基-3-己酮、3-甲基丁酸和甲基异丁基酮,其释放量与抑菌率呈显著正相关,其中3种（2-庚酮、2-壬酮和甲基异丁基酮）是前期研究已经报道过具有抑菌活性的物质,其余3种物质（5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮和3-甲基丁酸）暂未被报道具有抑菌活性,通过购买其中2种物质3-甲基丁酸和5-甲基-2-己酮进行体外熏蒸试验验证,发现3-甲基丁酸严重抑制小孢根霉生长,5-甲基-2-己酮对小孢根霉具有致死作用。5-甲基-2-己酮主要由菌株麦克默多生孢八叠球菌、短短芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌释放,5-甲基-3-己酮主要由菌株假单胞菌、阿氏芽孢杆菌和麦克默多生孢八叠球菌释放,3-甲基丁酸主要由菌株神户肠杆菌、假单胞菌和阿氏芽孢杆菌释放。【结论】 水稻根系细菌能释放种类丰富的挥发性有机物,部分挥发性有机物对水稻病原菌小孢根霉具有显著抑制作用。经过相关性分析及体外验证确定了2种新型的具有抑菌活性的物质（5-甲基-2-己酮和3-甲基丁酸）以及1种可能具有抑菌活性的物质（5-甲基-3-己酮）,这些菌株和挥发性有机物均具有作为新型药物和抗真菌代谢物生物资源的潜力。     

秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响

【目的】研究不同秸秆添加量对土壤固氮速率及固氮菌群落结构的影响,为我国秸秆还田及化肥减施增效提供支持。【方法】采用室内培养试验,除对照（C0: 0）外共设5个秸秆添加梯度（C1：0.2 mg·g^-1;C2：1.0 mg·g^-1;C3：2.0 mg·g^-1;C4：4.0 mg·g^-1;C5：10.0 mg·g^-1）,采用¹⁵N₂标记的方法,在黑暗条件下培养28 d后收集土壤样品,进而对生物固氮速率进行定量,利用Illumina PE250高通量测序和荧光定量PCR技术分析固氮功能基因nifH的丰度及群落特征。【结果】随着秸秆添加量的增加,土壤硝态氮含量显著下降,铵态氮含量无显著变化,土壤pH有下降趋势。同时,生物固氮速率显著增加,C3、C4及C5处理在培养期间（28 d）潜在固氮速率为87—96 kg N·hm^-2·a^-1,相比于对照提高了38.1%—52.4%。各处理固氮微生物nifH基因拷贝数变化范围为5.48×10⁷—9.20×10⁷ copies/（g soil）,其中,相比于C0,C4及C5处理固氮微生物nifH基因拷贝数均显著提高（P<0.05）。随着秸秆添加量的增加,C4、C5水平的香农-威尔指数显著低于其他4个处理（P<0.05）,其他4个处理多样性无显著差异。主成分分析（PCoA）结果显示土壤固氮微生物群落结构主要因秸秆添加量差异而聚集为不同组别。固氮微生物在门水平上分为变形杆菌（Proteobacteria）,蓝细菌（Cyanobacteria）,厚壁菌（Firmicutes）和放线菌（Actinobacteria）和螺旋体菌（Spirochaetes）。随着秸秆添加量的增加,蓝细菌相对丰度有先增加再降低的趋势;在属水平上,不同优势菌属对秸秆添加量的响应存在明显差异,慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）为数量最丰富菌属,随着秸秆添加量的增加,C5相较于C0、C1、C2、C3水平相对丰度差异显著（P<0.05）,显著增加了12.07%—14.13%。与生物固氮速率呈正相关的贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）随着秸秆添加量的增加其相对丰度逐渐增加,但当秸秆添加量达C5水平其相对丰度反而降低（P<0.05）。同时,最小偏二乘路径分析（PLS-PM）,冗余分析(RDA)及相关性分析表明生物固氮速率和土壤固氮微生物群落受秸秆添加量和NO₃^--N含量影响较大。【结论】土壤生物固氮速率随着秸秆添加量的增加而增加,秸秆对固氮的促进作用主要源于秸秆添加降低了土壤NO₃^--N含量,进而促进慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）和固氮螺菌属（Azospirillum）等固氮菌属微生物的生长。根据本试验结果计算,相比于不添加秸秆,添加秸秆4.0 mg·g^-1后,土壤生物固氮速率约增加26 kg N·hm^-2·a^-1,可显著降低我国氮肥需求。     

不同土壤玉米根际挥发性有机物组成和微生物群落特征

【目的】土壤理化性质和微生物群落的差异显著影响玉米根际挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs) 的产生和释放。对根际VOCs的深入研究有望为充分挖掘根际生物学潜力和根际调控做出积极贡献。【方法】采集山东德州、河北涞水、河北保定、江西南昌、河南孟津、河南商丘等6个地区的旱地耕层土壤进行为期两个月的玉米盆栽试验,利用顶空固相微萃取联合气相色谱–质谱联用检测技术对根际土壤挥发性有机物进行了分析鉴定,利用实时荧光定量PCR技术对根际细菌和真菌进行了定量分析,利用高通量测序技术对根际细菌16S和真菌ITS进行了测序。【结果】从6个旱地土壤中共检测出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中多种化合物与植物或微生物的生长代谢密切相关。胺类化合物N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide和D-2-Bromolysergic acid diethylamide在6个土壤中均被检出,占总量的54.2%;其次检出最多的是烷烃和烯烃,占总量的31.1%和7.6%。江西南昌土壤释放的VOCs在数量和丰富度上均显著高于其他土壤,且大部分为烷烃和烯烃类化合物;从河北保定土壤中检出了6种特有的有机酸和酯类化合物。供试6种土壤中,河南商丘和河北保定的细菌数量显著高于其他四个地方。南昌土壤真菌数量显著较高,但其细菌数量、丰富度和多样性均显著低于其他土壤。6种土壤中的主要细菌依次为Thaumarchaeota(奇古菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门) 和 Unclassified(未分类门),占总细菌群落的92.1%;主要真菌依次为Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门) 和 Chytridiomycota(壶菌门),占总真菌群落的98.3%。绿弯菌门仅在南昌土壤中占绝对优势,而南昌土壤中奇古菌门和变形菌门的相对丰度显著比其他地区少;子囊菌门在6种土壤中均为绝对优势真菌门。玉米根际释放的VOCs数量和丰富度与pH、硝态氮、细菌多样性和真菌多样性呈显著负相关 (P < 0.05),与铵态氮和真菌数量呈极显著正相关 (P < 0.01);与主要细菌门中的奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关 (P < 0.05),与绿弯菌门呈极显著正相关 (P < 0.01),但是与主要真菌门相关性不显著。【结论】理化性质不同的玉米根际土壤中,微生物群落结构与组成存在显著差异。pH是影响微生物生长的重要因素,酸性土壤中的真菌数量显著高于中性土壤,但是其细菌数量、微生物群落丰富度和多样性均显著小于中性土壤。VOCs的产生和释放受土壤、微生物和植物等众多因素的影响,土壤有机质含量越高、透气性越好、微生物数量越多时,释放的VOCs越丰富。