用宏基因组学方法研究绿肥对水稻根际微生物磷循环功能基因的影响

  【目的】  绿肥对土壤微生物磷循环的影响受到研究者们的广泛关注，但绿肥影响土壤磷循环的微生物机理尚不明确。利用宏基因组学方法剖析长期绿肥还田对土壤磷循环功能微生物的影响，旨在阐明绿肥对土壤磷循环影响的微生物机理，为绿肥的科学利用提供依据。  【方法】  以中国湖南祁阳绿肥及稻草还田定位试验的水稻根际土为材料，利用宏基因组学方法，对土壤微生物DNA进行PE150 (双端读长150 bp) 宏基因组测序，使用MetaWRAP软件中的read_qc模块进行质控，用assembly模块megahit方法进行组装；基于组装的较长序列 (> 1000 bp) 使用Diamond软件的BLASTX和UniProtKB/SWISS-PROT数据库进行序列比对，根据磷活化 (磷酸酯矿化、膦酸酯矿化、无机磷溶解)、磷吸收 (膦酸酯运输、磷酸酯运输和无机磷酸盐运输) 和缺磷诱导响应调控三大类主要磷循环功能相关基因 (重点关注的64个磷循环功能基因) 进行筛选；再利用R语言进一步分析水稻根际土壤中磷循环功能基因相对丰度及其与土壤理化指标之间的关系，阐述绿肥对土壤磷循环功能微生物的影响。  【结果】  土壤pH等9个常规指标在有、无绿肥处理之间均无显著差异。无稻草还田时，绿肥处理对64个磷循环功能基因中的11个相对丰度影响显著，这11个基因广泛分布在除磷酸酯运输及无机磷溶解外的5个功能组中，其中phnA、phnN、phnV等3个基因相对丰度上升，phnI、phnL、glpB、glpO、pitA、phoA、phoP、phoU等8个基因相对丰度下降。而在稻草还田时，绿肥处理仅phnPP基因相对丰度显著降低。相关性分析显示，土壤pH与磷酸酶活性、无机磷溶解基因pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E、pqqF相对丰度呈显著负相关 (P < 0.05)；无机磷溶解pqqB、pqqC 、pqqCD、pqq E等4个基因相对丰度分别与有效磷含量、磷酸酶活性以及有机氮含量呈显著正相关 (P < 0.05)。冗余分析 (RDA) 结果表明，绿肥处理通过pH、AP以及磷酸酶活性影响磷循环功能基因。  【结论】  绿肥翻压下水稻根际微生物磷功能基因相对丰度深受稻草还田的影响。与单绿肥或单稻草还田相比，绿肥翻压基础上增加稻草还田对磷循环功能基因影响效果不明显，秸秆甚至减弱了绿肥对磷循环功能基因的影响，其原因可能是绿肥和稻草还田下不同微生物及不同磷循环功能基因之间存在激烈竞争。     

UPLC-MS/MS同时测定土壤中19种植物激素方法的建立和验证

[目的]本文旨在建立土壤中多种植物激素的提取及超高效液相色谱串联质谱法,并用此方法同时测定土壤中茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素,玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯、脱落酸、赤霉素、水杨酸共19种植物激素含量。[方法]以根标土壤为试验材料,采用异丙醇水甲酸(80∶19∶1,V/V/V)作为提取剂,经过超声、离心后得到植物激素提取液,提取液于常温条件下真空浓缩至干,采用甲醇进行复溶,得到植物激素待测液。采用Waters ACQUITYUPLC■HSST3色谱柱对19种植物激素进行分离,以0.30 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.01%甲酸)作为流动相A和0.30 mmol/L甲酸铵乙腈(含0.01%甲酸)作为流动相B进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃;采用超高效液相色谱串联质谱,多反应监测离子模式进行定性定量分析,其中,茉莉酸、吲哚-3-乙酸、反式玉米素、玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤、吲哚-3-丁酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、独脚金内酯、玉米素、二氢玉米素核苷、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、二氢玉米素、吲哚-3-羧酸、茉莉酸甲酯、油菜素内酯采用正离子模式扫描,脱落酸、赤霉素、水杨酸采用负离子模式扫描;采用外标法测定植物激素回收率。[结果]在本试验浓度范围内,上述19种植物激素浓度与对应峰面积的相关系数(r)均大于0.99,检出限介于0.02~1.06 ng/g之间,19种植物激素的加标回收率为70.2%~117%,相对标准偏差介于0.20%~7.3%之间。采用优化后的实验方法测定土壤中的植物激素,结果检测出吲哚-3-乙酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸和独角金内酯5种植物激素,含量为0.55~5.79ng/g。[结论]本方法前处理不需要过夜浸提,加入二氯甲烷后,超声离心浓缩复溶后可直接进样检测,大大缩短了样品的前处理时间,超高效液相色谱串联质谱法操作简单,选择性好,灵敏度高,可实现土壤样品中多种植物激素的同时检测,为土壤中植物激素的深入研究提供了一种有效的研究方法。     

不同土壤玉米根际挥发性有机物组成和微生物群落特征

【目的】土壤理化性质和微生物群落的差异显著影响玉米根际挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs) 的产生和释放。对根际VOCs的深入研究有望为充分挖掘根际生物学潜力和根际调控做出积极贡献。【方法】采集山东德州、河北涞水、河北保定、江西南昌、河南孟津、河南商丘等6个地区的旱地耕层土壤进行为期两个月的玉米盆栽试验,利用顶空固相微萃取联合气相色谱–质谱联用检测技术对根际土壤挥发性有机物进行了分析鉴定,利用实时荧光定量PCR技术对根际细菌和真菌进行了定量分析,利用高通量测序技术对根际细菌16S和真菌ITS进行了测序。【结果】从6个旱地土壤中共检测出44种VOCs,主要是烷烃、烯烃、酯类、胺类、有机酸和芳香类化合物,其中多种化合物与植物或微生物的生长代谢密切相关。胺类化合物N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide和D-2-Bromolysergic acid diethylamide在6个土壤中均被检出,占总量的54.2%;其次检出最多的是烷烃和烯烃,占总量的31.1%和7.6%。江西南昌土壤释放的VOCs在数量和丰富度上均显著高于其他土壤,且大部分为烷烃和烯烃类化合物;从河北保定土壤中检出了6种特有的有机酸和酯类化合物。供试6种土壤中,河南商丘和河北保定的细菌数量显著高于其他四个地方。南昌土壤真菌数量显著较高,但其细菌数量、丰富度和多样性均显著低于其他土壤。6种土壤中的主要细菌依次为Thaumarchaeota(奇古菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门) 和 Unclassified(未分类门),占总细菌群落的92.1%;主要真菌依次为Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门) 和 Chytridiomycota(壶菌门),占总真菌群落的98.3%。绿弯菌门仅在南昌土壤中占绝对优势,而南昌土壤中奇古菌门和变形菌门的相对丰度显著比其他地区少;子囊菌门在6种土壤中均为绝对优势真菌门。玉米根际释放的VOCs数量和丰富度与pH、硝态氮、细菌多样性和真菌多样性呈显著负相关 (P < 0.05),与铵态氮和真菌数量呈极显著正相关 (P < 0.01);与主要细菌门中的奇古菌门、变形菌门和酸杆菌门呈显著负相关 (P < 0.05),与绿弯菌门呈极显著正相关 (P < 0.01),但是与主要真菌门相关性不显著。【结论】理化性质不同的玉米根际土壤中,微生物群落结构与组成存在显著差异。pH是影响微生物生长的重要因素,酸性土壤中的真菌数量显著高于中性土壤,但是其细菌数量、微生物群落丰富度和多样性均显著小于中性土壤。VOCs的产生和释放受土壤、微生物和植物等众多因素的影响,土壤有机质含量越高、透气性越好、微生物数量越多时,释放的VOCs越丰富。