高通量核酸液相芯片检测法对H5、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒的检测

为建立禽流感病毒和新城疫病毒的液相芯片快速检测方法,试验设计并合成针对H5、H9亚型禽流感病毒HA基因以及新城疫病毒NP基因的特异性引物、探针及探针反向序列,并将下游引物和探针反向序列进行生物素标记。将探针与不同编号的荧光编码微球偶联。通过将探针-荧光编码微球偶联物与HA、NP基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪检测荧光信号建立禽流感和新城疫快速液相芯片检测方法。结果显示,该法具有较高的特异性和灵敏度,非特异性反应很小,无明显交叉反应,该液相芯片快速高通量检测方法可同时检测新城疫病毒、H9亚型和H5亚型禽流感病毒,三株病毒毒株抗原的检测灵敏度分别为10~(-4)、10~(-5)和10~(-5)。同时,检测结果显示:三个毒株同步检测与单个毒株分别检测在检测的灵敏上度基本相当。研究建立的可以同时检测新城疫病毒、H9亚型和H5亚型禽流感病毒的快速高通量液相芯片方法,为该类病毒的检测提供了一种新工具,同时也为其他类似病毒的检测提供了借鉴。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器研究(英文)

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N'-(3-二甲氨基)丙基碳化二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒(NDV)反应,检测灵敏度达到20～100个EID50。[结论]该结果为检测禽流感病毒免疫传感器的进一步深入研究奠定了基础,这为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

鹿流行性出血病病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血病病毒(EHDV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中EHDV的VP7基因进行序列分析,设计EHDV特异性探针并用生物素标记,与荧光编码微球偶联后与病毒VP7基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip200)检测荧光信号建立了EHDV快速高通量液相芯片检测方法。检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度为100个TCID50。建立了快速检测EHDV的液相芯片技术,为进一步搭建EHDV快速高通量检测平台奠定了基础。     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础.     

抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

制备抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体;依据淋巴细胞杂交瘤技术,用纯化的H5N1亚型AIV和重组噬菌体T4-H5HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选特异性单克隆抗体;获得6株抗H5亚型AIVHA的特异性单克隆抗体H5-01（1E6）、H5-02（2C2）、H5-03（2A8）、H5-04（2G6）、H5-05（2E9）和H5-06（3F6）。各株单抗亚型测定的结果为：H5-01、H5-02为IgG1,H5-03、H5-04为IgG2a,H5-05、H5-06为IgG2b,轻链的亚型均为kappa链;经特异性和与同型病毒的反应谱检测,6株均是抗H5亚型AIVHA特异性单克隆抗体,为进一步分析H5N1亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒A06株单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)A06株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合.经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D12、4E10、6E2和7G6.其细胞培养上清效价分别为1:256、1:512、1:512和1:256,小鼠腹水效价分别为1:1.024×106、1:2.048×106、1:1.024×106和1:2.048×106.亚型鉴定表明,3D12、4E10、6E2和7G6分别为IgG2b、IgG2b、IgG1和IgG2a.ELISA检测结果显示,4种PRRSV单克隆抗体仅与PRRSV反应,不与其他病毒反应,表明均为抗PRRSV的型特异性单克隆抗体.对单克隆抗体腹水液进行IgG提取纯化,SDS-PAGE电泳验证,仅出现两条清晰条带,无杂带出现,证明纯化效果较好.这4种单克隆抗体的获得,为建立PRRSV检测方法提供了强有力的工具.     

表达马立克氏病病毒CVI988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB）基因构建成重组鸡痘病毒（rFPV）。以MDV　GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV－gB／R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV－gB／R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV－gB／R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV－gB／R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

赤羽病ELISA检测方法的建立及试剂盒的研制

为了提高赤羽病的检测速度与效率,建立双抗夹心ELISA检测方法并进行试剂盒的研制。试验用纯化的AKV免疫BALB／c小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选出3株分泌抗AKV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞（1D1、1812和2G1）,各杂交瘤细胞株均可以稳定地分泌特异性单克隆抗体,且其单克隆抗体亚型测定的结果均为IgG1、轻链均为k链。建立DAS--ELISA检测方法,确定抗AKV单克隆抗体1812株的最佳包被浓度为4μg／mL,多克隆抗体最佳稀释比为1：500,二抗最佳工作浓度为1：5000,阴性／阳性结果判定临界值为0．238,具有较好的特异性,检测极限为10^-4。表明该方法及试剂盒具有较强的实用价值。     

凡纳滨对虾鳃组织对高温和氨氮胁迫的生理响应

[目的]明确高温和氨氮单因素胁迫及二者复合胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃组织的毒性效应,为开展凡纳滨对虾健康养殖提供理论依据.[方法]将体质健康的凡纳滨对虾随机分成4组,即对照(正常海水)组、高温(33℃)胁迫组、氨氮(15 mg/L)胁迫组、高温与氨氮复合胁迫(氨氮浓度15 mg/L,水温33℃)组.胁迫72 h后,从每个平行中随机挑取凡纳滨对虾鳃组织制作石蜡切片观察其病理变化,并采用试剂盒测定鳃组织生理功能指标的变化情况.[结果]经高温和氨氮单因素胁迫或二者复合胁迫后均致使凡纳滨对虾鳃组织发生病理性结构变化,表现为角皮层变薄或消失,上皮细胞逐渐分解,入鳃和出鳃血管变形或裂解,鳃丝连接松散,腔内出现液泡等.凡纳滨对虾鳃组织超氧阴离子自由基(O-2·)和过氧化氢(H2O2)含量均在氨氮胁迫后显著降低(P<0.05,下同),但经高温胁迫和高温与氨氮复合胁迫后无显著变化(P>0.05,下同);总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性在高温或氨氮胁迫后均显著升高;谷氨酸脱氢酶(GDH)活性在高温和氨氮单因素胁迫及二者复合胁迫后均显著升高;谷氨酰胺酶(GLS)活性经氨氮胁迫后显著升高,经高温胁迫和高温与氨氮复合胁迫后则显著降低;己糖激酶(HK)活性在高温胁迫后显著降低,经氨氮胁迫后显著升高;乳酸脱氢酶(LDH)活性仅在氨氮胁迫后显著升高;酸性磷酸酶(ACP)活性经氨氮胁迫后显著升高,而在高温胁迫和高温与氨氮复合胁迫后均显著降低.[结论]经高温和氨氮单因素胁迫或二者复合胁迫后,凡纳滨对虾鳃组织出现明显的病理性变化,其氧化应激、氨氮代谢和能量代谢相关生理指标均发生显著变化.氨氮胁迫造成对虾鳃组织生理紊乱,且高温胁迫加重氨氮毒性,而降低对虾鳃组织生理功能.因此,对虾健康养殖特别是工厂化高密度养殖过程中因避免高温环境下氨氮胁迫对凡纳滨对虾的毒性效应.