柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】 了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】 根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑（Fortunella japonica）和敏感品种枣阳小叶枳（Poncirus trifoliata）的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】 金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20（GenBank登录号分别为MN689609和MN689608）序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列（GenBank登录号分别为MN689611和MN689610）虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】 CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因 CsAP2-09 超表达植株为材料，利用 GST融合蛋白沉降技术（GST pull-down）联合液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）方法筛选并鉴定 CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化 GST-CsAP2-09 作为诱饵蛋白，然后与 CsAP2-09 超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行 SDS-PAGE 验证，最后进行 LC–MS/MS 鉴定。得到 17 个互作蛋白，将蛋白进行注释、GO 分析、KEGG 分析，发现其中 5 个可能与植物抗病相关（如过氧化氢酶 Cs3g27280）。构建这 17个蛋白的互作网络，其中 14 个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对 CsAP2-09 与互作蛋白的共表达分析发现 CsAP2-09 超表达引起了 16 个蛋白表达上调和 1 个蛋白表达下调。     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β-1,3-葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

柑橘溃疡病抗性SNP验证及其相关钙依赖性蛋白激酶基因诱导表达

【目的】前期根据转录组数据挖掘柑橘单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点,通过关联分析获得14个与柑橘溃疡病耐/感性关联的SNP。以此为基础,本研究利用柑橘杂交群体验证这些位点与柑橘溃疡耐/感性的相关性,以期获得显著相关的SNP,并对其相关的基因进行柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和植物激素诱导表达分析。【方法】以抗病和敏感柑橘品种及其杂交F₁代群体共143个材料为试材,采用离体叶片针刺接种法进行溃疡病抗性鉴定;利用高分辨率熔解曲线（high resolution melting,HRM）技术,对F₁群体进行SNP分型;使用DPS软件对F₁群体的溃疡病耐/感性表型和SNP基因型进行相关分析;实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析其中一个SNP相关的柑橘钙依赖性蛋白激酶基因（calcium-dependent protein kinase gene,CDPK）的诱导表达模式。【结果】供试杂交F₁代群体的病斑面积在0.75—3.29 mm²;病情指数在30.2—100,而抗病品种‘金弹’病情指数为11.1,敏感品种‘冰糖橙’病情指数为100。病情指数较低的杂交后代,其亲本至少有1个为耐病性品种,母本耐病性强的居多。根据病情指数确定免疫材料1个,高抗17个,中抗31个,中感38个,高感56个。SNP分型结果显示,14个SNP位点在143个供试材料间均有多态性,可分为3种不同的基因型,2种纯合型和1种杂合型。简单相关分析结果表明,多个SNP位点的基因型与病斑面积及病情指数相关性显著。典型相关分析结果显示,其中5个SNP位点与病斑面积相关性较高,相关系数绝对值均>0.2,其编号分别为HP31、HP42、HP85、HP87、HP170,可利用这5个SNP位点的基因型预测柑橘溃疡病耐性的强弱。其中SNP位点HP31位于CsCDPK（CAP ID: Cs4g10370）的编码区,对柑橘离体叶片接种溃疡病菌诱导处理6、12、24、48和72 h后进行基因相对表达量分析,发现‘金弹’（高抗）、‘新生系3号椪柑’（中抗）和‘冰糖橙’（高感）中该基因的表达量均呈先升后降趋势,且均在48 h其相对表达量达到最高;接菌处理后12 h,‘金弹’中该基因的相对表达量为对照的3倍,而‘新生系3号椪柑’和‘冰糖橙’中无明显差异。此外,CsCDPK受水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）诱导表达,且在不同溃疡病耐/感性品种中该基因诱导表达的模式不同。【结论】获得5个与溃疡病耐/感性显著相关的SNP,可用作柑橘溃疡病耐/感性筛选标记。SNP位点HP31相关的CsCDPK受溃疡病菌和SA、MeJA和ABA诱导表达,该基因可能在柑橘应答溃疡病菌侵染的信号转导过程中具有重要功能。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。