纽荷尔脐橙贮藏枯水相关ESTs分离与初步分析

 为分析柑橘果实贮藏过程中枯水相关特异基因的表达情况,以纽荷尔脐橙（Citrus Sinensis Osbeck）采摘后贮藏至略见枯水果实的果肉为测验方（Tester）,以刚采摘果实的果肉为驱动方（Driver）,采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）技术成功构建了贮藏果实差减cDNA文库,共获得656个阳性克隆。随机挑取克隆进行菌液PCR分析,插入片段长度主要集中在100 ~ 1 000 bp。成功对213个克隆进行测序,获得有效序列143条,经序列分析,共得到53条uniESTs序列。在NCBI基因库中对这53个uniESTs进行BLAST分析,比对结果参照MIPS的分类标准,按功能分为14类,其中参与代谢、能量及蛋白合成的ESTs最多,分别占到了全部ESTs的17%、11%和13%。     

CjFRO2在转基因枳中的整合与表达

三价铁螯合物还原酶（Ferric-chelator reductase,FCR）在植物对三价铁的吸收过程中起着关键作用,导入外源三价铁螯合物还原酶基因是改良植物耐缺铁能力的有效途径。香橙（Citrus junos Sieb.ex Tanaka）是目前表现最好的柑橘耐缺铁砧木之一,在铁胁迫时,香橙三价铁螯合物还原酶基因（...     

抗菌肽Shiva A基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传与表达分析

为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据.     

应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因

为筛选分离植物根组织特异表达基因,以枳根RNA为试验组,叶RNA为驱动组,构建了枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列1 177个,其片段长度主要分布在200 ~ 500 bp;序列拼接后得到455个非重复序列,其中245个与已知基因匹配,具有结合功能、催化活性和转运活性等生物学功能,可参与植物的代谢、细胞生长、个体发育、应激反应等生物学过程。实时定量PCR检测结果显示这些基因中的主要乳液蛋白、早期结瘤素样蛋白和贝壳杉烯酸氧化酶等基因在根中高表达。     

柑桔转基因研究进展

柑桔基因工程育种因其具有周期短、效率高、可控性强等优点而成为柑桔育种的重要内容之一。本文就柑桔转基因研究的品种及外植体、柑桔转基因研究所采用的方法、导入柑桔的外源基因进行了综述,最后提出了柑桔遗传转化中存在的问题并对柑桔转基因研究进行了展望。     

柑橘栽培品种（系）DNA指纹图谱库的构建

 【目的】构建柑橘栽培品种（系）的DNA指纹图谱数据库,为建立柑橘种苗纯度及真实性鉴定技术体系和技术规范奠定基础。【方法】利用SSR标记和ISSR标记对102个柑橘栽培品种（系）进行DNA指纹分析,筛选适合的特征引物,构建柑橘栽培品种（系）的指纹图谱数据库。【结果】从200对SSR引物中筛选到重复性好、多态性丰富的12对引物作为柑橘品种（系）鉴定的特征引物,12对SSR特征引物组合可鉴别42个品种（系）;在此基础上,对未出现SSR特征指纹的60个品种（系）进行ISSR指纹分析,从40个ISSR引物中筛选到2个可用于品种鉴定的特征引物,结合SSR标记,可快速、准确地鉴别70个柑橘的品种（系）。并利用这12对SSR特征引物和2个ISSR特征引物构建了70个柑橘栽培品种（系）的DNA特征指纹图谱数据库。【结论】SSR和ISSR标记适于构建柑橘栽培品种DNA指纹图谱库;指纹图谱库的建立为柑橘种苗纯度及真实性鉴定奠定了基础。     

柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】 了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】 根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑（Fortunella japonica）和敏感品种枣阳小叶枳（Poncirus trifoliata）的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】 金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20（GenBank登录号分别为MN689609和MN689608）序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列（GenBank登录号分别为MN689611和MN689610）虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】 CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。     

柚类种质资源表型多样性分析及综合评价

为了建立合理的柚类分类系统并为柚类育种提供参考,本研究以82份柚类种质资源为试材,采用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数、方差、相关性、主成分、聚类、回归分析等对其26个表型性状进行多样性分析、差异分析及综合评价。结果表明:这82个品种的26个性状的变异系数为0.26%。其中翼叶面积和果心面积变异较大,其他性状遗传特性较稳定;单果重、果横径、果形指数、果皮厚、囊瓣数、种子数、果心长和宽、叶片长和宽、叶片面积、花瓣宽、花柄长等性状等级分布均匀,翼叶面积、花瓣数、雄蕊长分级较少且分布不均;来源于中国大陆以外品种的果皮厚、叶柄长、翼叶长,明显优于长江流域和珠江流域来源的材料,但雌蕊长则相反;选育品种的叶片长、宽和面积显著大于遗传材料和地方品种;82个品种可聚为大翼叶大果型、大翼叶小果型,小翼叶大果型,小翼叶小果型4个类群;前7个主成分累计贡献率75.57%,包含了柚类表型性状的大部分信息;26个性状F平均值0.45,其中早暹柚得分最高为0.69,红肉琯溪蜜柚最低为0.24;囊瓣数、种子数等12个性状与F值极显著相关;回归方程筛选出单果重、囊瓣数等19个性状。本研究说明柚类种质资源具有较高的表型多样性,筛选出的19个性状可作为柚类综合评价指标,为柚类育种提供科学依据。