柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

过氧化氢酶基因CsKat01与柑橘溃疡病相关性分析

为了探究过氧化氢酶基因Cs Kat01在柑橘抵御溃疡病过程中的作用,对感病品种‘晚锦橙’和抗病品种‘四季橘’中Cs Kat01进行了生物信息和表达分析,并探究了溃疡病菌接种处理后两品种中CAT酶活性和H2O2含量的关系。克隆Cs Kat01的编码序列并对该基因及其编码蛋白进行结构和功能分析,发现Cs Kat01编码框全长为1482bp,共编码493个氨基酸残基,蛋白序列中含有典型的CAT结构域;通过启动子序列克隆和分析发现‘晚锦橙’和‘四季橘’核心启动子区域均含有水杨酸、茉莉酸和脱落酸的响应元件,但数量不同;利用q RT-PCR分析水杨酸、茉莉酸、脱落酸和柑橘溃疡病菌(Xcc)对Cs Kat01的诱导表达特性,发现Cs Kat01的高表达可能使柑橘相对更感病;结合Xcc诱导后植物组织中Cs Kat01酶活性和H2O2含量,综合分析Cs Kat01、CAT酶活、H2O2含量和柑橘对溃疡病抗性之间的关系,推测Cs Kat01基因可能通过调控CAT的酶活性,改变H2O2含量进而影响柑橘对溃疡病的抗性。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

黄龙病菌侵染晚锦橙叶脉和根早期病原蛋白组学的比较分析

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,由于黄龙病病原菌无法离体培养,其关键的致病机制仍不清楚。为此,通过蛋白组学分析探究黄龙病菌侵染晚锦橙早期时病原蛋白的表达情况。【方法】利用叶圆片嫁接技术对晚锦橙(Citrus sinensis Osbeck)进行嫁接传毒,在传毒2个月时,对感病后的根和叶脉组织进行蛋白组测序,以黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)基因组为参考,对测序结果进行注释,并以感病叶脉为对照,筛选病原菌差异表达蛋白,最后利用qRT-PCR对显著性差异表达蛋白质进行验证。【结果】共鉴定出38个病原蛋白,其中有6个显著性表达差异蛋白;GO功能注释揭示这些病原蛋白主要与核酸结合和物质转运活性相关;qRT-PCR结果显示,6个显著差异蛋白在根部组织中的表达水平显著高于叶片组织;其中ABC转运系统重要组成成分CLasMalE(ACT56611.1)转运蛋白基因的表达倍数高达595倍。【结论】在黄龙病菌侵染柑橘根和叶的早期,与病原菌物质运输和核酸代谢相关基因的表达差异明显,暗示其在黄龙病菌侵染寄主中起着重要作用,为黄龙病菌致病机制研究提供了基因资源和理论基础。     

‘Cocktail’葡萄柚黄龙病菌检测及鉴定

采用直接组织免疫印迹(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)和常规PCR技术,对采自广东梅州新建‘Cocktail’葡萄柚园内表现疑似黄龙病症状的样品进行检测。DTBIA检测发现疑似样品的韧皮部存在特征性紫红色反应,与黄龙病阳性对照反应一致。PCR检测发现枝条、叶片和果实样品中均检测出了黄龙病菌特异性条带,其中果蒂、中柱和种皮内病菌含量较高。进一步测序分析发现,来自‘Cocktail’葡萄柚病样的16Sr DNA和ef Tu基因与NCBI中的柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)对应基因的序列相似性均为100%,证实‘Cocktail’葡萄柚感染了柑橘黄龙病菌亚洲菌株。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

甜橙完整叶片培养芽直接发生与解剖观察

甜橙(Citrus sinensis)茎段在MS+KT 1.5mg/L+2.4—D 1.0mg/L培养基上形成的愈伤组织是由皮层与韧皮部薄壁细胞发生的。愈伤组织在MS+BA2.0mg/L+NAAO.2mg/L培养基上分化出丛芽,去掉NAA后有利于丛芽的生长。甜橙试管苗完整叶片在MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基上培养15天后,出现叶面生芽。这种芽由叶脉维管束薄壁细胞。或维管束附近的叶肉细胞分裂后直接分化而成。叶面生芽主要分布在叶的主脉或侧脉处。     

桃PpPGIP1 启动子的分离与功能分析

 通过染色体步移法分离桃[Prunus persica（L.）Batch]PpPGIP1 上游启动子序列,利用生物信息学方法对其功能进行初步预测;构建该启动子植物表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草,研究不同激素诱导条件下GUS 蛋白瞬时表达情况;并利用实时荧光定量RT-PCR 技术分析了PpPGIP1 在水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和1–氨基环丙烷–1–羧酸（ACC）诱导下的表达特性,获得了长度为1 018 bp 的桃PpPGIP1 启动子序列。该序列与梅和中国李PGIP 启动子序列的同源性分别为90%和89%;该启动子序列含有SA、MeJA、ABA 和ETH 诱导调控相关的抗病与胁迫顺式作用元件;ABA 和ACC 可以诱导PpPGIP1 启动子调控GUS 基因的表达;实时荧光定量RT-PCR 分析结果表明：SA、MeJA、ABA 和ACC 都可以诱导桃叶片中PpPGIP1 的表达。PpPGIP1 可能参与SA、MeJA、ABA 和ETH的信号转导,在桃抵抗病原菌和逆境胁迫方面起着非常重要的作用。     

苹果bZIP转录因子基因MdAREB2功能的初步研究

对‘嘎拉’苹果中的1个bZIP转录因子基因MdAREB2(序列号:MDP0000248567)进行功能初步研究。蛋白进化树分析表明,苹果MdAREB2与拟南芥AtAREB2具有很高的同源性。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析,MdAREB2启动子序列中存在脱落酸响应元件ABRE。实时定量PCR检测表明,MdAREB2明显受ABA诱导。拟南芥种子萌发阶段经过0.5和2μmol·L~(-1)ABA处理后发现突变体abi5中过量表达MdAREB2能够恢复对ABA的敏感性。拟南芥幼苗生长阶段,经过20μmol·L~(-1) ABA处理后发现,突变体abi5中过量表达MdAREB2能够部分恢复对ABA的敏感性。