CD147基因在家兔肠道的克隆与结构预测

基于电子延伸序列,克隆并分析兔CD147基因.采用兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR反应,测序并进行结构预测.克隆的兔CD147基因包含一个完整的开放阅读框架,全长为810 bp,编码由270个氨基酸残基组成的CD147前体蛋白,推导的氨基酸序列信号肽为1～16个氨基酸.氨基酸序列与牛、人、褐鼠、野猪的同源性分别为62.5%,65.9%,59.5%和66.3%,三级结构预测表明CD147具有2个免疫球蛋白类似区.试验成功克隆了兔CD147基因,注册到GenBank(Accession.EU650668),并预测其三级结构,为进一步研究其生物学功能奠定基础.     

猪Chemerin和受体基因的克隆与组织分布

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了猪Chemerin和受体(ChemerinR)基因;各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序;结果表明:猪Chemerin cDNA克隆片段为558 bp,开放阅读框架为492 bp,编码有163个氨基酸.ChemerinR cDNA克隆片段为1 470 bp.开放阅读框架为1 092 bp,编码363个氨基酸.同源分析结果表明,猪Chemerin的核酸序列与牛、人和大鼠的同源性分别为86.7%,79.1%和73%,氨基酸序列的同源性分别为83.1%、83.4%和67.7%,ChemerinR的核酸序列与人、大鼠和小鼠的同源性分别为80.4%、77.6%和72.6%,氨基酸序列的同源性分别为88.2%、80.7%和79.3%.组织分布结果显示:猪Chemerin在多种组织均有分布,ChemerinR仅在膀胱、大脑和肌肉有分布.     

仔猪水通道蛋白基因的克隆及断奶应激对其在胃肠道组织mRNA表达的影响

水通道蛋白(AQP)作为一种膜转运蛋白,对于调控肠道组织的水分子转运具有重要作用。本实验利用同源序列克隆法设计引物,从仔猪(Susscrofa)的消化道组织中克隆AQPs家族基因(AQP2~AQP11)(GenBank登录号分别为EU636238、EU161094、EU165525、EU192130、EU620575、EU024116、EU220426、EU220427、EU582021和EU220425),并对其进行生物信息学分析。采用荧光定量PCR研究断奶应激对于仔猪胃肠道组织中AQP1、AQP3、AQP8和AQP11的mRNA表达影响。生物信息学分析发现,猪AQPs家族基因含有高度保守的天冬酰氨-脯氨酸-丙氨酸(NPA)结构序列,基因表达分析发现,断奶组仔猪的AQP1基因在十二指肠、回肠和结肠组织的mRNA表达量与对照组相比显著上调(P<0.05);AQP3基因在胃和小肠组织的mRNA表达有显著上调(P<0.05);AQP8基因在胃和回肠组织中mRNA表达有显著上调(P<0.01),在其他组织中没有显著差异;AQP11基因在空肠组织的mRNA表达量显著上调了1.7倍(P<0.05)。这些研究结果表明,AQP基因可能在断奶应激引起的仔猪肠道腹泻中发挥重要作用。     

猪Mighty基因的克隆与组织表达分析

Mighty基因是在骨骼肌中发现的一个新颖的肌形成前期因子。基于电子延伸序列,本试验成功克隆出了Mighty基因,其全长874 bp,开放阅读框为579 bp,编码有193个氨基酸,提交GenBank(EU559709)。同时,试验采取半定量RT-PCR法,以18S rRNA为内标,研究了Mighty基因在仔猪18个组织中的分布和mRNA的表达水平。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

猪肿瘤抑制基因候选5的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆了仔猪肿瘤抑制基因候选5(TUSC5),并初步分析其组织分布情况;获得了TUSC5基因的全长序列636bp,包括开放阅读框架(ORF)534bp,编码177个氨基酸。克隆的仔猪TUSC5基因与人、小鼠、大鼠的TUSC5基因序列的同源性分别为83.5%,82.4%,82.6%,推测的氨基酸序列同源性分别为71.2%,77.5%,78%,成功克隆了猪TUSC5基因。     

Sus scrofa interferon epsilon-1基因的克隆与序列分析

[目的]克隆分析Sus scrofa interferon epsilon-1基因,以期为其生物学功能研究奠定基础。[方法]利用Homo sapiens interferon epsi-lon 1(IFNE1)序列(NM_176891.3)对猪HTG库进行搜索,通过对获得的2个片断(CU074336、AC127471)的序列分析,在5'-UTR和3'-UTR设计1对克隆引物,对7日龄仔猪的胃组织进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序,并进行相关分析。[结果]同源性分析结果表明,猪SIFNE1与人、小鼠interferon epsilon-1基因cDNA编码区(CDS)的同源性分别为83.6%和69.2%;蛋白序列同源性分别为76.2%和55.2%。推测其氨基酸序列信号肽为第1～21位氨基酸,IFabd结构域为第59～176位氨基酸,结构特征与人、小鼠的interferon epsi-lon-1相一致。[结论]该研究克隆了Sus scrofa interferon epsilon-1基因,为进一步研究SIFNE1基因的生物学功能奠定了基础。     

仔猪组织基因表达中实时定量PCR内参基因的选择

实时定量PCR研究中需要选择表达稳定性高的内参基因才能准确地校正目标基因的表达量。以仔猪不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了beta-肌动蛋白（ACTB）、beta-2-微球蛋白（B2M）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、羟甲基胆素合成酶（HMBS）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）、核糖体蛋白L4（RPL4）、琥珀酸脱氢酶（亚基A）（SDHA）、TATA盒结合蛋白1（TBP1）和酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽（YWHAZ）共9个看家基因mRNA水平的表达情况。经geNorm程序统计学分析处理,结果表明,9个看家基因的表达稳定性为HMBS和HPRT1〉RPL4〉TBP1〉B2M〉YWHAZ〉SDHA〉GAPDH〉ACTB,确定了HMBS基因在仔猪不同组织中用于校正目标基因的表达量为最佳选择,而RPL4基因则可以作为高转录本的内参基因。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达栽体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白.结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586bp.ORF为582bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47kD.     

猪KISS-1基因克隆、序列分析

在猪的不同组织中克隆KISS-1基因,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E．coliDH5α,检测阳性克隆并测序;结果：克隆的猪KISS-1基因与牛、人、大鼠、小鼠同源性分别为81．0％、76．8％、71．4％、72．4％;克隆了猪KISS-1基因全长并注册GenBank（Accession．EU934235）,猪KISS-1基因在多种组织中表达。