兔CCR10基因的克隆与序列分析

摘 要：【研究目的】克隆并分析兔CCR10基因;【方法】基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,兔盲肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coli JM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析。【结果】克隆的兔CCR10 基因长为723bp,编码由241个氨基酸残基组成的CCR10前体蛋白,三级结构预测表明CCR10具有一个多克隆免疫球蛋白区（PIG-X）。克隆的兔CCR10基因与绵羊、人的同源性分别为89.6%、89.9%,推导的氨基酸序列与绵羊、人的同源性分别为94.2%、93.8%,结构特征与绵羊、人的相一致。【结论】克隆了兔CCR10基因并注册GenBank (Accession. EU348829)。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆新的猪MAPK12基因全长ORF，分析其生物特性，为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法：以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据，利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物，RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列，将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果 分离的ORF全长1101bp，编码367个氨基酸，与人鼠氨基酸序列92%同源；利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论 研究分离的基因片段可命名为猪ERK6，通过分析，获取了该酶的基本信息特征，并与现有的报道结果进行对比分析，为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

牦牛SRY基因克隆与分子特征

SRY(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)基因位于哺乳动物的Y染色体,对性别形成起着决定性作用.对高原牦牛SRY基因的编码区进行克隆和分子特征分析,以期从分子水平了解牦牛的性别形成机制.以雄性高原牦牛血液为材料,从基因组DNA中扩增SRY基因编码区(单外显子)序列,将其克隆至pGEM-T easy载体并测序.同时,将牦牛SRY基因编码区与奶牛进行序列比对;对牦牛SRY蛋白与其他物种SRY蛋白进行序列比对;采用在线生物软件对牦牛SRY蛋白的特性和结构进行预测.牦牛SRY基因(GenBank:EU547257)编码区长687 bp,编码229个氨基酸.克隆获得的牦牛SRY基因编码区与奶牛该序列存在2个碱基的变异,造成1个氨基酸的变异;各物种SRY蛋白具有较高的同源性;牦牛SRY蛋白(GenBank:ACB 29799)主要由亲水性氨基酸构成,同源建模预测的SRY HMG区域的3D模型显示,SRY HMG区域三维结构呈由三个α-螺旋组成的"L"型.首次从高原牦牛基因组中克隆了SRY基因,并进一步揭示了其分子特征,为从分子水平人为的控制牦牛性别奠定了重要基础.     

马铃薯可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因克隆及生物信息学分析

用RT-PCR方法从马铃薯中克隆了可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的cDNA片段,序列分析表明该cDNA片段全长为3 967 bp,开放阅读框为3 693 bp,编码1 230个氨基酸.核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的马铃薯SSⅢ基因(X94400)具有99%同源性,氨基酸序列同源性达98%.应用生物信息学软件对SSⅢ基因分析表明:其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点;蛋白质二级结构预测显示,有369个氨基酸可能形成α-螺旋结构,249个氨基酸可能形成β折叠,102个氨基酸可能形成β转角,510个氨基酸可能形成无规则卷曲;通过亚细胞定位可知,它是一种含有75个氨基酸的叶绿体转运肽蛋白.     

鸡集落刺激因子(CSF)基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中报道的红原锦鸡集落刺激因子(Colony-stimulating factor,CSF)cDNA序列,利用Primer Premier5.0软件设计一对特异性引物,对本地肉鸡注射100 μg/mL ConA试剂,饲养24 h后,取脾脏提取淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆集落刺激因子(CSF)的cDNA片段.对克隆片段进行测序,并利用DNAstar软件进行不同物种间同源性比较.序列分析表明,CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸,与红原锦鸡的序列比较,其核苷酸的同源性为98.4%,氨基酸的同源性为95.2%,同人、犬、印度野牛、野猪、绵羊和老鼠的CSF序列作比较,其核苷酸的同源性分别为28.7%,29.2%,33.6%,30.8%,29.4%和34.7%,氨基酸的同源性分别为8.3%,9.0%,15.3%,12.4%,11.0%和12.0%.然后利用DNAstar和DNAman软件,对鸡CSF的结构进行预测,结果表明,鸡CSF基因为一结构松散的蛋白分子.鸡的CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性.这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础.     

万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段的克隆及分析

为了研究万寿菊中玉米黄质生物合成途径的关键酶基因,首先根据不同物种的ZEP基因进行序列比对找到保守区域设计简并引物,然后利用RT-PCR方法,以万寿菊花瓣总RNA为模板克隆万寿菊ZEP基因cDNA的片段,并进行序列分析。结果表明,万寿菊ZEP基因片段长度为1 058 bp,编码352个氨基酸残基,其序列与其他植物ZEP基因同源性最大为92%;其翻译产物属于亲水性蛋白;且结构域预测结果发现TeZEP基因编码的氨基酸序列含有一个NADB_Rossmann超家族和玉米黄质环氧化酶的特征性结构黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。本研究成功克隆了万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段并对其进行了序列分析,这为进一步研究该基因功能提供了依据,也为构建转基因植物和沉默基因植株以提高玉米黄质合成量提供了一定的参考。     

绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基(NDHB)基因片段的克隆及同源性分析

克隆并分析绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基(NDHB)基因片段.根据GenBank上已发表的NDHB氨基酸序列,设计合成了一对简并引物,采用RT-PCR技术对绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因进行扩增,将扩增的PCR产物与pMD18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析.克隆的绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因cDNA序列长893bp,由288个氨基酸残基组成,命名为FvndhB.序列比对结果表明FvndhB与参考的8个物种的NDHB在核酸水平上表现出较高的同源性,其与桑树、银白杨、按树、烟草、拟南芥、银杏、台东苏铁、日本柳杉NDHB核苷酸序列同源性分别为84.32%、83.88%、83.43%、82.86%、82.18%、78.82%、77.07%、71.23%.利用DNAMAN软件构建的系统进化树显示绒毛白蜡与其他植物亲缘关系较远.成功获得了绒毛白蜡FvndhB基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步克隆绒毛白蜡FvndhB全长基因及分析其表达特性奠定了基础.     

人参属植物鲨烯合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

利用生物信息学方法对GenBank中人参属9种植物鲨烯合酶的cDNA序列以及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域功能域和进化关系进行了初步预测和分析。结果表明：总体上人参属鲨烯合酶核苷酸序列相似性平均为96.245%,氨基酸相似性平均为95.5%。其二级结构预测结果显示9个鲨烯合酶氨基酸序列以α螺旋和无规则卷曲为主要组成部分。对9种人参属植物进行进化树分析发现可以分为2个亚族。对包括人参属9种植物在内的其他物种进行进化树分析可知,植物、动物、酵母分属不同的类群。通过分析人参属植物鲨烯合酶及其编码基因的生物信息学特征,可以为鲨烯合酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。     

灯盏花ARC1基因的克隆及序列分析

本研究对灯盏花ARC1基因进行克隆及序列分析。根据实验室前期预测灯盏花的序列设计引物,以灯盏花花蕾为材料提取RNA作为模板,通过反转录(RT-PCR)扩增得到cDNA,作为PCR扩增的模板,将扩增的ARC1基因连接到p MD19-T上,阳性克隆经PCR检测后进行测序结果分析,得到2 199 bp的核酸序列。序列分析结果表明,该基因存在2个结构域,不存在内含子,编码733个氨基酸,其核酸序列的同源性达到64%以上,氨基酸序列同源性达61%。本研究首次从灯盏花中克隆出ARC1基因,为后期研究该基因提供理论基础。     

几种植物白藜芦醇合酶基因保守序列的克隆与分析

根据GenBank中登录的一些植物的白藜芦醇合酶基因(resveratrol synthase,RS)保守序列设计引物,采用PCR技术从葡萄科植物(蛇葡萄、三叶爬山虎、五叶爬山虎和云南爬山虎)、桑科植物(桑树)和豆科植物(花生)的幼嫩叶片中扩增出该基因的DNA片段。测序结果表明,片段长635 bp,6个片段均不含内含子,分别编码211个氨基酸,均包含白藜芦醇合酶基因的特异片段和芪合酶(stilbene synthase,STS)家族特异性信号序列。     

荷斯坦奶牛IFN-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

利用RT-PCR技术从荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增IFN-γ(ccIFN-γ)基因,克隆至pMD18-T载体进行测序。测序结果表明,ccIFN-γ基因全长501bp,编码166个氨基酸,其中前23个氨基酸残基构成信号肽序列,后面147氨基酸残基构成成熟肽,其中含有2个潜在的N-链糖基化位点。二级和三级结构预测发现,ccIFN-γ蛋白分子中存在7个的α-螺旋,中间由无规卷曲连接,折叠成由α-螺旋包绕的中空状结构。将ccIFN-γ成熟肽编码区序列进一步克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达出与预期大小(20.6KDa)相符的重组蛋白,占菌体蛋白18.6%。Western blot检测证实表达的融合蛋白为牛IFN-γ,这为进一步开展重组ccIFN-γ生物学活性的研究奠定了基础。     

棉花育性相关基因GhPG2的克隆与表达分析

多聚半乳糖醛酸酶家族是一个细胞壁水解酶,在许多高等植物的花粉中都具有高水平外切多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,可能在花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要作用。利用已报道与恢复基因连锁的分子标记STS679筛选陆地棉Y18恢复系核基因组BAC文库,获得一个阳性克隆Z55E7,对该克隆测序获得6个基因,其中一个为编码多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)基因,暂被命名为GhPG2。在棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系中对该基因进行序列和表达分析,以便进一步了解该基因与棉花细胞质雄性不育的关系。从BAC克隆中分离到GhPG2基因,对其进行序列分析,以半定量RT-PCR和实时定量PCR分析该GhPG2基因在棉花恢复系、保持系和不育系各个组织中的表达模式。分离到GhPG2基因的基因组序列为1 518 bp,其开放阅读框序列为1 239 bp,共编码412个氨基酸,包含PG基因家族的4个保守结构域。系统进化树分析表明,GhPG2基因与其他物种花粉表达的PG基因同属C分支。表达分析表明, 该基因在恢复系和保持系的花药、花瓣和VI级花蕾中高表达,而不育系的相应组织该基因表达量明显降低。GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因。实验结果暗示GhPG2基因可能与棉花正常的花器官发育相关。     

梅花PmCBF基因的克隆及表达

CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因一致;4℃处理后PmCBF基因的表达开始上升,4 h时达最大,初步表明PmCBF在低温胁迫下上调表达。     

陆地棉水通道蛋白GhNIP6.1基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR技术,从陆地棉品种苏棉18中克隆获得了一个水通道蛋白基因GhNIP6.1。该基因开放阅读框包含903个核苷酸,编码300个氨基酸,分子量为30.97kD,理论等电点为8.99。GhNIP6.1蛋白的生物信息学分析表明:GhNIP6.1含有6个跨膜区,由5个环相连,其中环A、C和E在细胞膜外,环B、D和蛋白的N、C末端都位于细胞膜内,N末端79个氨基酸,C末端18个氨基酸,具有MIP家族典型的保守氨基酸序列;该蛋白的三级结构同拟南芥的AtNIP6.1非常相似,亚细胞定位也同AtNIP6.1一致,可能位于质膜中。进化分析发现,GhNIP6.1蛋白同拟南芥的AtNIP6.1蛋白相似性最高。进一步扩增棉花核基因组获得了2021bp的DNA序列,它包含5个外显子和4个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则。半定量分析表明,该基因在根、茎和叶中都有表达,其中真叶含量较高,子叶中没有表达。     

大白菜DREB类转录因子cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的大白菜自交系85-1为材料,利用RT-PCR技术获得了大白菜DREB类转录因子基因的cDNA编码序列,命名为BcDREB1(GenBank登录号为:EU924266).序列分析表明,BcDREB1核苷酸序列长663 bp,编码214个氨基酸,含有一个典型的AP2结构域,具有DREB转录因子的典型特征.将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了大白菜BcDREB1基因的植物表达载体pCAM-BcDREB1,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础.     

植物病原菌群体猝灭基因克隆及诱导表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。研究利用PCR方法从枯草芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明,该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为87%～96%。将该基因置于诱导型启动子PPP3调控下,连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物诱导表达载体pCAM-PPP3-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

杨梅肌动蛋白基因MrActin1的克隆及表达分析

扩增杨梅嫩叶中肌动蛋白基因(MrActin1)全长编码区cDNA序列,并评价MrActin1的进化地位,同时分析MrActin1的表达模式。利用RT-PCR扩增MrActin1全长编码区cDNA序列。用生物信息学手段分析预测MrActin1的理化性质和同源性,用临接法构建其的系统发生树。通过Northern blot分析MrActin1在不同组织部位的表达。该基因cDNA序列（GenBank登录号AB 650589）全长1137 bp,编码了1个由377个氨基酸残基组成的蛋白质,所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin氨基酸序列的相似性均在88%以上,根据高等植物Actin相似性构建了进化树,表明MrActin1与陆地棉、圆叶锦葵Actin之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。Northern blot分析表明,MrActin1在杨梅的花、叶、枝条和果组织中恒定表达。首次获得了杨梅MrActin1 cDNA全长序列。