草莓叶黄素循环关键酶基因VDE和ZEP的克隆与分析

叶黄素循环在逆境胁迫中对植物光系统起着重要的保护作用。紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZEP)是调控叶黄素循环的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE技术率先从草莓中克隆获得VDE和ZEP基因。VDE基因c DNA全长1 842 bp,ORF为1 467 bp,编码489个氨基酸;ZEP基因c DNA全长2 325 bp,ORF为1 980 bp,编码660个氨基酸。生物信息学分析表明草莓VDE与ZEP基因所编码的氨基酸序列与蔷薇科的苹果、桃和梅等植物的亲缘关系较近。荧光定量分析发现VDE和ZEP基因在草莓根、茎、叶、花、果实中皆有表达,说明二者均为组成型表达基因,并且叶片中基因的表达量最高而根中最低,推测与其在草莓叶黄素循环调控的作用有关。     

大豆候选草酸氧化酶基因片段克隆与表达分析

为克隆大豆草酸氧化酶基因并初步鉴定其功能,根据双子叶植物的草酸氧化酶基因,设计简并引物,同源克隆大豆该基因片段,实时定量PCR分析基因表达情况。序列分析发现,基因片段大小504 bp,无内含子,编码168个氨基酸;Blastx同源比对发现,与大豆的germin基因和苜蓿、花生的草酸氧化酶基因高度同源;草酸诱导大豆耐病和感病种质叶片基因表达分析表明,基因的表达与草酸诱导有关,而且在耐菌核病种质与感菌核病种质间,表达量和表达时间差异明显。推断该基因片段可能是一具有草酸氧化酶活性的大豆germin基因片段。     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

桃果实ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

乙烯是调控果实成熟衰老的内源激素,有效地调控乙烯的生物合成便是控制果实成熟的关键,而ACC氧化酶是植物乙烯生物合成途径中的限速酶之一。本研究以成熟的白粉桃为材料提取果实总RNA,克隆ACC氧化酶基因,旨在利用反义技术抑制乙烯合成,延迟桃果实成熟,提高硬度。将克隆片段与pMD18-T载体连接并转化到E.coliDH5α,经PCR、酶切和测序鉴定。分析表明该基因全长为1246bp,其中编码区长960bp,共编码319个氨基酸,与已登陆的ACC氧化酶基因(AF319166)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99%和98%,表明成功的克隆了ACC氧化酶基因。经生物信息学分析,推测该蛋白的分子式为C1626H2542N420O485S12,相对分子质量为36.12kDa,等电点为5.27;该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主,是一个紧凑型球状结构域。     

玉米ZmCKX基因的克隆及分析

细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。     

4种梨的多酚氧化酶基因克隆及其序列比较

以4种不同来源的梨基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶基因序列设计引物,利用PCR技术,克隆到了鸭梨、雪花梨、砂梨、黄冠梨约1．8kb的完整多酚氧化酶基因,将纯化后的扩增产物克隆到质粒pGEM-T veetor中,转化DH-5α菌,挑选阳性克隆进行测序。利用Clustalx软件对PPO核苷酸序列进行了同源性分析,用DNAStar软件对PPO核苷酸序列进行进化树分析,并进行部分植物PPO氨基酸的同源性分析。结果表明,4种梨多酚氧化酶基因的蛋白编码区含有1782个核苷酸,鸭梨基因已经在GenBank上登录,登录号为EU048225。梨多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子结合部位,所有的植物基本上一致;5种梨的同源性高达98％。基于植物PPO基因核苷酸序列的分子进化树显示,可分为两大类,梨的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。     

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3′端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72％-80％,氨基酸相似性为82％～87％。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。     

萼脊兰TUB基因片段的克隆及序列分析

为了给筛选萼脊兰内参基因和研究TUB基因的生理功能提供研究基础,对萼脊兰TUB基因片段进行克隆与序列分析。采用CTAB法提取萼脊兰盛花期花瓣总RNA,并运用RT-PCR方法克隆萼脊兰TUB基因序列,长度为1 055 bp,编码351个氨基酸残基,氨基酸序列中存在微管蛋白的保守区域GGGTGSG。序列分析结果表明:与其他已登录物种的TUB基因相比,其核苷酸序列的同源性达75%~96%,与朵丽蝶兰(JN185665.1)同源性高达96%,氨基酸序列的同源性也在96%以上,且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性。在Gen Bank注册,登录号为KP686397。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

全明星草莓乙烯受体Etr1基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙烯受体Etr1基因片段,为进一步研究Etr1基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础.以全明星草莓成熟果实中分离到得基因组DNA为模板,经PCR扩增到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pEGM-T easy vector上经测序分析,基因全长617 bp,编码205个氨基酸.序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr1的cDNA序列同源性98%,氨基酸序列同源性97%.     

棉花叶绿体70S核糖体S7蛋白基因的克隆和序列分析

叶绿体基因组具有高度保守性，来源于不同植物的叶绿体基因同源性很高。应用ＰＣＲ技术，从棉花叶绿体基因组扩增并克隆了长度为１．０ｋｂ的叶绿体ＤＮＡ片段。该片段含有叶绿体核本小亚基Ｓ７蛋白基因ｒｐｓ７。采用限制性内切酶消化连接的策略构建亚克隆，并测定了该片段的含部核苷酸序列。结果表明，棉花叶绿体ｒｐａｓ７基因与烟草、不稻的相庆基因同源性高，分别为９７．９％和８９．５％，３非编码区的同源性分别为９６．３％     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

柽柳冷适应蛋白基因

冷适应蛋白(CAP)是指生物体受到寒冷刺激后,诱导表达的一类特异蛋白质,由冷诱导有关的基因在冷诱导过程中启动转录和翻译的。低温条件下,冷适应蛋白表达量在持续不断增加,对低温条件下蛋白质合成的调节以及mRNA的折叠起重要作用。是一类重要的与细胞耐寒相关基因。我们从构建的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库中分离得到了冷适应蛋白基因片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因cDNA序列长度为1176bp,其中开放读码框(ORF)从49到663碱基位置,长度为615bp,编码204个氨基酸组成的多肽,预测其蛋白质分子量为23kD,预测其理论等电点为9.23。该基因已经在GenBank上注册,其基因序列登录号AY587773,氨基酸序列登录号为AAT01418。该基因的克隆为植物分子育种提供了新的基因资源。     

棉花光合基因GhRCAα启动子的克隆及活性分析

为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一致;将克隆的GhRCAα启动子片段以烟草叶片为受体材料进行瞬时表达分析表明,GhRCAα启动子可以驱动GUS基因的表达,表明克隆的启动子片段具有驱动目标基因表达的活性。克隆的GhRCAα启动子可能是一种组织特异型启动子,有望用于植物的遗传转化,进而更好地调控重要基因的特异性表达。     

巴西橡胶树一个Mlo基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是植物抗病基因中的重要成员。巴西橡胶树Mlo基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病橡胶树新品种奠定基础。本研究以大麦Mlo基因(GenBank登录号: Z83834)为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,最后得到巴西橡胶树Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因CDS片段1668 bp,编码555个氨基酸,分子量为63.14 kDa,等电点是8.85。对巴西橡胶树Mlo的编码蛋白结构域进行分析发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含8次跨膜结构。通过对不同物种的Mlo同源蛋白进行聚类分析发现,巴西橡胶树Mlo蛋白与木薯Mlo蛋白同源性最高,达到92.1%,其次是蓖麻(87.6%);在拟南芥基因组中,与AtMlo8的相似性最高,达到67%,而且AtMlo8也包含有8次跨膜结构,因此,将巴西橡胶树中克隆的Mlo基因命名为HbMlo8。通过对所克隆的HbMlo8基因分析可知,该基因属于Mlo基因家族成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证巴西橡胶树HbMlo8的功能奠定了基础。     

夏枯草苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是迷迭香酸合成途径中的关键酶之一,根据其他植物PAL基因的保守区域设计特异引物,利用3’-RACE-PCR技术,本研究首次从夏枯草中克隆得到了PAL基因的cDNA片段序列,命名为PvPAL,Gen-Bank登录号为JN65446。PvPAL基因cDNA片段长1 306 bp,其中编码区域为1 047 bp,编码349个氨基酸。蛋白质序列多重比较结果显示,PvPAL蛋白质序列与丹参、地黄、黄芩、藿香等植物的PAL蛋白质高度同源。PAL系统进化树分析结果表明,PvPAL与唇形科植物的PAL基因亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,PvPAL基因在根、茎、叶中均表达,其中根中表达量最高。PvPAL基因的克隆为进一步研究夏枯草迷迭香酸合成的分子机制奠定了基础。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。