甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

牡丹PsDREB转录因子基因的克隆及亚细胞定位

DREB转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着非常重要的调控作用。本研究以芍药科芍药属牡丹‘洛阳红’品种叶片提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个1 661 bp的DREB(dehydration responsive element binding protein)基因的cDNA序列,包含1 089 bp的开放阅读框、448 bp的5'非编码序列和124 bp的3'非编码序列,命名为PsDREB。该基因的cDNA编码363个氨基酸,与葡萄、梧桐、杨树和咖啡的同源性分别为61%、60%、56%和55%。为进一步验证其功能,本研究通过基因枪法对该基因编码的蛋白进行了亚细胞定位检测,结果发现该蛋白定位于细胞核,符合转录因子细胞核定位的特征。研究结果为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆及鉴定

脱水响应元件结合因子(DREB)是一类对多个抗逆相关基因表达起调控作用的植物特有的转录因子,在植物抗逆能力综合改良方面具有重要作用。本研究通过筛选花生未成熟种子的cDNA文库,分离到一个DREB类基因——PNDREB1(FM955398)。该基因序列长度为687 bp,推测编码蛋白含有229个氨基酸残基,相对分子量为24.7 kD,理论等电点为5.97,与其他物种中该类转录因子序列同源性较高。利用酵母单杂交系统,对花生PNDREB1与DRE元件的特异识别和结合能力及其C-末端转录激活活性进行检测,显示,转入含有该基因及阳性对照基因的载体均可使酵母菌株正常生长,且具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,证明基因PNDREB1中的AP2结构域具有和DRE元件特异性结合的能力;同时,只有转入含有该基因C-末端片段及阳性对照基因的载体可使酵母菌株正常生长,并具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,说明其C-末端片段具有转录激活活性,该基因为DREB类转录因子。基因表达模式分析显示,PNDREB1为组成型表达,且被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐和ABA处理没有响应。     

独行菜种子DREB类转录因子家族及LaDREB表达对幼苗冷胁迫响应

DREB是广泛存在于植物中的一类重要的转录因子,其调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,在植物抗逆方面起重要作用。本研究在转录组数据基础上,比较了独行菜(Lepidium apetalum Willd.)种子在实验室条件耐受和不能耐受低温萌发的两组样本,对其DREB转录因子家族成员进行了分析,并对该家族成员表达差异极显著的基因LaDREB进行了克隆、序列分析、结构预测,研究了其表达在独行菜幼苗中对低温胁迫的响应。结果表明,萌发中的独行菜种子,至少有13个DREB转录因子表达,相对于低温萌发停滞组,在低温萌发耐受组的独行菜种子中,有1个下调、10个上调、2个表达差异不显著。其中表达量最显著上调的c18023_g1序列,包含639 bp的开放阅读框,功能注释到DREB类基因,与宽叶独行菜LiDREB序列一致性最高,因此该基因命名为LaDREB。其编码210 aa的蛋白质、具有典型AP2结构域、分子式为C1927H3217N639O815S124、理论等电点为5.18、分子量为52.352 9 k D。定量表达分析表明,LaDREB在独行菜幼苗期,经低温处理后,其表达量快速显著上调,表明LaDREB可能在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用,为深入探讨LaDREB转录因子在独行菜幼苗耐受低温中的作用提供理论参考。     

黑果枸杞LrDREB1基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

DREB(Dehydrate responsive element binding factor)转录因子是植物非生物逆境适应中的关键调节因子,该类转录因子具有保守的AP2/EREBP结构域,在低温、高盐等非生物逆境胁迫下,可调控下游逆境应答基因的表达,对增强植物的抗逆能力有重要作用。黑果枸杞具有极强的耐干旱、盐碱能力,为研究黑果枸杞DREB类基因在低温、盐碱响应中的功能,本研究以强抗盐灌木黑果枸杞总RNA为模板,基于前期转录组测序拼接序列,利用RT-PCR方法克隆得到一条DREB基因。该基因含有一个1116 bp的开放阅读框,编码372个氨基酸。系统进化树分析显示,Lr DREB1基因属于DREB亚家族A2组成员,与拟南芥AtDREB2B、AtDREB2E具有较高的相似性。荧光定量PCR结果显示,Lr DREB1受盐胁迫、ABA胁迫和低温胁迫诱导表达,可能参与依赖ABA的信号转导途径,调节黑果枸杞抗盐响应。本研究通过对黑果枸杞LrDREB1基因的克隆、序列分析和表达分析,为研究Lr DREB1的功能及黑果枸杞抗盐机理提供了帮助。     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。     

棉花TCP家族转录因子基因GhTCP1的克隆与表达分析

通过比对拟南芥、金鱼草、水稻和玉米等植物中已知TCP家族转录因子的氨基酸序列,根据保守区设计兼并引物,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早13号的DNA为模板,获得棉花转录因子基因GhTCP1的中间保守区序列。根据该段序列设计特异性引物,采用5'和3'RACE技术获得了全长cDNA序列,编码397个氨基酸。基因组DNA序列分析表明,GhTCP1基因含有一个内含子。棉花GhTCP1蛋白与其它植物中的TCP家族转录因子有较高的相似性,证明该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示,该基因在棉花的侧芽中特异表达。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

割手密2个DREB2基因的克隆与比较分析

干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB),在植物应对干旱、盐碱和低温胁迫的反应中起非常重要的调控作用。利用已知的甘蔗栽培种DREB2转录因子序列,设计引物,按照同源克隆的方法,获得了2个割手密DREB2基因组DNA序列,分别命名为Ss DREB2-a和Ss DREB2-f(Gen Bank登录号分别为:KU963272和KU963277)。序列分析结果表明,Ss DREB2-a基因序列全长为1 578 bp,Ss DREB2-f基因序列全长为1 729 bp,2个基因均包含1个内含子和2个外显子。Ss DREB2-a和Ss DREB2-f基因的c DNA序列全长分别为824 bp和971 bp,均编码262个氨基酸。序列比对分析显示,2个基因的序列相似性为96.6%,编码的蛋白相似性为98.9%,存在3个氨基酸变异位点。系统进化分析结果显示,割手密DREB2转录因子与高粱、牛鞭草、斑茅、玉米等植物的DREB2转录因子的同源关系最近。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与割手密抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。     

割手密DREB2类转录因子的克隆与比较分析

DREB类转录因子是一类植物中特有的,在非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。本研究以割手密为材料,采用同源基因克隆的方法克隆获得2个DREB2类转录因子基因Ss DREB2-1和Ss DREB2-2(Gen Bank登录号分别为KU963264和KU963265)。序列分析表明,这2个基因的长度分别为814 bp和709 bp,分别编码262和227个氨基酸;预测其蛋白质分子量分别为28.66 k D和24.95 k D,等电点(PI)分别为5.42和6.47。氨基酸亲水/疏水性分析表明,这2个转录因子属于亲水性蛋白。多序列比对分析表明,两基因序列的相似性为98.7%。原核表达分析表明,这2个基因编码区能正常表达出目的蛋白,说明得到的这2个基因为功能基因而非假基因。     

大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析

采用基因芯片技术,从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法,拼接了该基因的全长序列,并通过RT-PCR克隆了该基因。Blast检索分析表明,该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子,且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高,将该基因命名为GmTINY1。GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸残基。GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。系统发生分析表明,GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支,且同属于DREB亚家族。实时定量RT-PCR检测表明,GmTINY1基因在荚中高丰度表达,在花中的表达量也较高,在根中的表达量较低,而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果表明,GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论,GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发挥调控作用,可能与种子发育过程中种脐的形成有关。     

DREB1B基因在转基因小麦后代的稳定表达

本研究对基因枪导入了pBAC128F/R质粒(含有玉米Adh1内含子1的CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记,以来自拟南芥菜逆境诱导表达类型--亲水蛋白rd29b基因的启动子驱动脱水应答转录因子DREBIB基因的逆境诱导表达类型质粒)的T4代转基因小麦进行了稳定表达研究.PCR、PCR-Southem和Southern杂交分析表明,外源转录因子DREBlB基因已稳定整合到转基因株系的基因组中.半定量RT-PCR结果表明,部分转基因株系的DREB1B基因的相对表达量有所增强.叶片除草剂抗性检测结果显示有8个转基因株系可抗到150 mg/L.叶片脯氨酸含量测定结果表明,有4个株系(编号为1,18,30和76)的脯氨酸含量提高幅度较大,同一株系,干旱与未干旱处理相比,脯氨酸含量提高了3～5倍.干旱处理后的转基因植株与非转基因植株相比,脯氨酸含量高2～3倍.在干旱条件下,T4代田间小区产量统计数据分析结果表明,有4个转基因株系(编号为30,51,70和76)的产量与非转基因植株相比有显著增加.研究表明,利用逆境诱导型rd29b基因的启动子来增强外源DREB1B基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性.     

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。     

露地菊(Chrysanthemum×grandiflora)CgDREB基因克隆和生物信息学分析

DREB转录因子在植物抗逆过程中起关键性作用,它可以激活一系列抗逆功能基因的表达从而综合提高植物的抗逆性。为探究露地菊DREB基因的功能,本研究通过结合RNA-Seq和RT-PCR技术从露地菊‘纽9717’中克隆得到CgDREB基因,并对该基因及其蛋白进行生物信息学和表达模式分析。结果显示,CgDREB基因ORF全长450 bp,编码149个氨基酸,预测蛋白相对分子量16.742 kD,理论等电点9.32,为亲水性蛋白,没有跨膜结构,无信号肽。功能结构域分析表明其具有一个高度保守的AP2/ERF结构域。同源性分析其属于AP2/ERF转录因子家族DREB亚组A-5组。蛋白质二级结构中无规则卷曲占57.05%,α-螺旋占28.86%,延伸链占10.07%,β-转角占4.03%。三级结构显示其以单体蛋白结构存在。RT-qPCR分析表明,高盐、干旱、低温和ABA均能诱导CgDREB基因的表达。本研究为深入了解露地菊A-5组DREB转录因子及其抗逆调控机制提供基础,为露地菊品种改良提供理论依据。     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆(Glycine max)中克隆了一个与抗逆相关的DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) 基因GmDREB5。功能分析证明, GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白, 采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73~226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库, 发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域, 与棉花(Gossypium hirsutum)和水稻(Oryza sativa)的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性, 说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基, 将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109, 转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上(SD/ trp- leu- his- ade-)正常生长, 而对照不能生长; 同时, 共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达, 证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明, GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达, 证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应, 同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。