果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalactuionasem, PG)是一种细胞壁结构蛋白,可以催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,使细胞壁结构解体,导致果实软化。本文采用qRT-PCR方法,分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明：(1)采用RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩增多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA,其全长为1143 bp,命名为CsPG1 (GenBank登录号为KR296662),编码380个氨基酸残,根据侵染油菜叶片的表达量,确认CsPG为基因家族的主效基因;(2)将CsPG1基因连接pET28a(+)载体并转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3),获得包涵体形式,但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白;(3)最适CsPG1包涵体溶解的尿素浓度6 mol L^–1,采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白CsPG1进行了重折叠复性试验,经高亲和力的Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带,获得可溶性蛋白,复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为5.02 U mg^–1;(4)生物试验表明,CsPG1蛋白能够加速嘉陵40 (Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化,推测该蛋白与肥大性菌核病菌对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异,为果桑生产中菌核病的防控提供了分子证据.     

新疆药用植物黑桑的抗氧化性

为寻找一种天然的抗氧化材料,以新疆药用植物黑桑的根、枝、叶和果实的乙醇提取物为材料,进行总多酚、总黄酮、抗氧化能力以及螯合 Fe2+测定。结果显示：果实(桑椹)提取物(EEMF)的总多酚含量(0.9438 mg· mL -1)以及总黄酮含量(0.1747 mg·mL -1)与叶提取物( EEML)、枝提取物( EEMB)和根提取物( EEMR)相比并不高,但 EEMF的抗氧化能力最强,其清除羟基自由基、DPPH 自由基能力分别达到96.46%,96.83%,抑制脂质体氧化能力达到71.14%;此外,EEMF螯合 Fe2+能力也强于其他3种。表明黑桑4个部位都具有良好的抗氧化能力,且果实最佳。     

桑树ASR基因的克隆及表达特征分析

ASR(ABA-stress-ripening)基因家族广泛参与植物对逆境胁迫的响应过程,并对植物的生长发育及果实成熟等起着重要调控作用。根据川桑(Morus notabilis)基因组数据库中的ASR基因序列设计引物,在杂交桑品种桂桑优62的幼苗中克隆得到一个ASR基因,命名为Ma ASR(Gen Bank登录号:KP636800.1)。Ma ASR编码区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白质等电点5.20,分子质量32.18 k D。以果叶兼用多倍体桑品种嘉陵40号不同发育成熟期的桑椹为材料,通过实时荧光定量PCR分析显示Ma ASR在果实成熟发育早期的表达量较高,在后期的表达量较低。以桂桑优62幼苗为材料进行实时荧光定量PCR分析的结果表明:Ma ASR在茎和叶中的表达量较高,在根部的表达量最低;幼苗经脱落酸(ABA)、甘露醇处理后根部的Ma ASR表达水平上调,经钨酸钠处理抑制了Ma ASR在根和叶中的表达,经蔗糖与葡萄糖处理使Ma ASR在根和叶中的表达水平上调。推测Ma ASR基因参与桑树果实发育和成熟的调控以及幼苗的生长发育,而且能够响应ABA和甘露醇以及糖类等非生物因子的诱导。     

桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因MaPGIP1的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的细胞壁结合蛋白。采用RT-PCR从嘉陵40(Morus atropurpurea Roxb.)果实中扩增PGIP基因c DNA,利用生物信息学的方法分析其编码蛋白的结构和功能。结果表明,嘉陵40PGIP开放阅读框全长1017 bp,编码338个氨基酸残基,被命名为MaPGIP1。MaPGIP1蛋白分子量37.9 k D,等电点为为6.65,信号肽为N端26个氨基酸残基,具有4个潜在的N-糖基化位点。MaPGIP1蛋白的核心区域由9个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析,MaPGIP1蛋白以包涵体形式出现,Western blot证实了重组蛋白的特异性,经过Ni-NTA柱纯化和分步透析复性后获得可溶性蛋白,该蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)PG(Cs PG)活性,其最适pH值为4.5~5.0,最适温度30℃。抑菌试验结果表明,MaPGIP1蛋白在果桑肥大性菌核病菌菌丝侵染油菜叶片过程中具有一定的抑制效果。     

桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。     

桑树谷氨酸脱氢酶基因MaGDHs的克隆及表达分析

【目的】克隆桑树的谷氨酸脱氢酶基因GDH,了解其结构、组织特异性表达以及调控特点,并获得桑树谷氨酸脱氢酶蛋白,为进一步研究谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）在桑树氮代谢过程中的功能奠定基础,也为多年生木本植物的GDH研究提供参考。【方法】根据川桑基因组数据库搜索GDH同源序列设计引物,以杂交桑品种桂桑优62号（M. atropurpurea Roxb.）cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得MaGDHs。利用NCBI上BLAST和CDD进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MaGDH氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;通过qRT-PCR检测试管苗在不同浓度的蔗糖、铵盐、激素（6-BA）状态下MaGDHs的表达量,用StepOne Software V2.1软件根据2^-△△Ct法进行基因相对表达量分析。以pET-28a(+)、pET-32a(+)、pCold-TF为载体构建MaGDH的融合蛋白重组质粒并转入到大肠杆菌中进行表达。【结果】成功获得2个MaGDHs,序列全长均为1 236 bp,编码411个氨基酸,含一个开放阅读框,分别命名为MaGDH1和MaGDH2。MaGDH1蛋白质的分子量为44.1 kD,理论等电点为5.84,MaGDH2蛋白质的分子量为44.2 kD,理论等电点为6.68。MaGDHs氨基酸序列含有9个外显子,8个内含子,具有线粒体转移肽、Glu/a-KG结合域和NAD(P)结合域,与川桑同源性均为99%,与双子叶植物同源性为90%左右,与单子叶植物的同源性为85%左右。重组蛋白MaGDHs以包涵体的形式在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,经过纯化和复性后获得了具有活性的酶蛋白,酶活性以pET-28a(+)-MaGDH1重组蛋白最高,为10.07 nmol·min^-1·mL^-1。MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑花中表达量最高,其次是嫩叶,在果实中几乎不表达。MaGDHs的表达受到蔗糖、NH₄⁺和6-BA的调控。随着蔗糖浓度的增加,MaGDHs表达量增加;过量的NH₄⁺促进MaGDH1的表达,而没有NH₄⁺的情况下,MaGDHs也有表达;细胞分裂素对MaGDHs的表达是先抑制后促进,MaGDH1在24 h后表达增强,MaGDH2在48 h后表达增强。【结论】从桂桑优62号中获得了两个MaGDHs,分别编码β和α亚基。不同载体的重组蛋白酶活性存在差异。MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑树生长旺盛的组织中表达量较高。过量NH₄⁺促进MaGDH1表达;MaGDH1响应激素促进表达比MaGDH2早。