狂犬病毒蚀斑方法对病毒毒力滴定及口服免疫犬血清的检测

1 前言目前对于狂犬病毒及抗体的检测国内大多数科研及生产单位仍沿用经典的小鼠脑内滴定法。此法不仅周期长(约2—3周)、操作麻烦、亦不经济。本试验应用已建立的快速半微量蚀斑方法(周期5—6天),对不同的狂犬病毒株进行了毒力滴定,同时也对口服免疫的犬血清进行了检测,进一步证实了该方法的科学性及实用性。 2 材料和方法     

狂犬病病毒不同毒株蚀斑特性的动态学研究

应用已建立的狂犬病病毒的蚀斑方法,对狂犬病病毒的强毒株鹿8202株、弱每株Flury及无毒变异株SRV_9的蚀斑特性做了比较研究,发现不同的狂犬病病毒株其蚀斑特性存在一定的差异。     

狂犬病病毒8202毒株在BHK_(21)细胞上蚀斑方法的建立

狂犬病病毒在普通细胞培养过程中一般无明显的细胞病变.毒力的滴定较为困难.国内大多数实验室仍然应用经典的小鼠脑内滴定法.此法持续周期长(2～3周),操作麻烦,亦不经济.我们应用甲基纤维素(MC)代替普通琼脂建立了狂犬病病毒的蚀斑方法.     

以琼脂糖为覆盖物的鹿狂犬病病毒蚀斑方法及应用

在BHK_(21)细胞上,以琼脂糖作为覆盖物,建立了狂犬病病毒的蚀斑方法.此法特异、敏感、稳定,周期短,5～6d可用肉眼判定结果,可用于狂犬病病毒的鉴定、克隆、滴定及中和抗体检测.     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞,ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。     

狂犬病口服疫苗的研究

从巴斯德开创性地研制成功抗狂犬病疫苗以来已经一个多世纪,但是关于狂犬病的免疫接种问题仍未根本解决。现用于各种动物的狂犬病疫苗,虽都有较好的免疫预防作用,但因都是注射用疫苗,大量推广比较困难,而对于野生动物狂犬病的