高效液相色谱法测定青贮饲料桑中的乳酸、乙酸和丙酸含量条件探讨

本文应用高效液相色谱法（HPLC）对青贮饲料桑中的乳酸、乙酸和丙酸含量测定进行了研究。通过对色谱柱、流动相、流速及样品处理条件进行优化，建立了一种应用HPLC法同时测定青贮饲料桑中乳酸、乙酸和丙酸含量的方法。研究结果表明：乳酸、乙酸和丙酸在一定浓度下具有良好的线性关系，且相关系数R2均大于0.999，加标回收率为98.35% ~ 104.24%，标准品中回收率和精密度试验相对标准偏差（RSD）为0.01%~0.58%，表明该方法准确性较好。3种物质检出限为4.928 ~ 9.489 mg/L，适用于青贮饲料桑中有机酸的定量检测。 [关键词] 高效液相色谱（HPLC）|青贮饲料桑|乳酸|乙酸|丙酸     

水合氯醛对蒙古马血气及乳酸的影响研究

为了研究水合氯醛对蒙古马血气及乳酸的影响,从而评估水合氯醛对蒙古马生理指标的影响程度.对16匹成年蒙古马静脉注射8％水合氯醛溶液,分别在0、10、20、30、40、50、60 min时间点采集动脉血,进行血气及乳酸检测.结果发现,动脉血pH值、PO2麻醉后呈先下降后回升的趋势,PCO2、乳酸麻醉后呈先上升后下降的趋势.表明水合氯醛对蒙古马体内的酸碱平衡、氧合水平及细胞损伤都有显著的影响.本次研究数据可为今后相关研究提供数据依据和参考.     

表达猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌的构建及其对结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用

本试验旨在构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的重组乳酸乳球菌(L. lactis),并评价其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型小鼠肠道损伤的修复作用,为将表达pEGF重组L. lactis应用于断奶仔猪肠道保护提供重要的依据。设计含有3个拷贝数的pEGF同向串联基因序列,并进行L. lactis密码子优化,将合成的3pEGF基因片段与表达载体pNZ8148连接,构建表达pEGF的重组L. lactis。选用32只BALB/c小鼠,随机分为4组,每组8只。采用4%的DSS建立小鼠结肠炎模型,各组小鼠具体处理如下:正常对照组,试验第1～12天饮用自来水;DSS模型对照组,试验第1～7天饮用4%的DSS水溶液,第8～12天饮用自来水;L. lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时每天口服1×1012CFU L. lactis,连续12 d;重组L. lactis组,饮水按照DSS模型对照组处理,同时口服1×1012CFU表达pEGF的重组L. lactis,连续服12 d。结果显示:1)通过序列鉴定可知,3pEGF基因成功转入L. lactis;Western blot分析表明所表达的pEGF能与特异性抗体相结合,初步证明该重组蛋白具有活性。2)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠长度显著降低(P0.05);与DSS模型对照组相比,重组L. lactis组小鼠结肠长度显著增加(P0.05)。3)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠闭锁蛋白(occludin)浓度显著降低(P0.05),D-乳酸(D-LAC)浓度显著升高(P0.05),二胺氧化酶(DAO)活性极显著升高(P0.01);与DSS模型对照组相比,重组L. lactis组小鼠结肠occludin浓度显著升高(P0.05),D-LAC浓度显著降低(P0.05),DAO活性极显著降低(P0.01)。4)与正常对照组相比,DSS模型对照组小鼠结肠白细胞介素-10(IL-10)浓度极显著降低(P0.01),白细胞介素-4(IL-4)浓度显著降低(P0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度极显著增加(P0.01);与DSS模型对照组相比,重组L. lacits组小鼠结肠IL-10浓度极显著增加(P0.01),IL-4浓度显著增加(P0.05),TNF-α浓度有降低的趋势。由此可见,本试验成功构建了表达pEGF的重组L. lacits,重组pEGF具有良好生物活性;小鼠口服表达pEGF的重组L. lacits可抑制结肠的缩短,改善结肠结构和通透性,调节细胞因子浓度到达正常水平,这说明表达pEGF的重组L. lacits维护了肠道屏障功能的完整性,对损伤的肠道具有一定修复作用。     

‘蜂糖李’果实发育过程中有机酸含量变化及其与苹果酸代谢相关酶的关系

【目的】明确‘蜂糖李’果实有机酸组成与含量特点,揭示其发育过程中有机酸含量的变化规律及其与苹果酸代谢相关酶的关系,阐明有机酸积累的关键时期和关键酶。【方法】以‘蜂糖李’及对照‘四月李’为材料,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatograph,HPLC)分析测试李果实发育过程中有机酸组分及含量,并测定苹果酸代谢相关酶的活性。【结果】利用高效液相色谱分析李果实中有机酸组分及含量,发现‘蜂糖李’果实成熟时总酸含量(ω,后同)为5.94 mg·g-1,包括苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、莽草酸和琥珀酸6种,其中以苹果酸含量最高(占总酸含量的88%),‘四月李’果实中有机酸组分与‘蜂糖李’一致,均属于苹果酸型。2个李品种果实中总酸含量的差异主要是由苹果酸含量的差异所致。通过分析李果实发育过程中有机酸含量的变化,发现‘蜂糖李’果实中苹果酸含量大量积累的关键时期在果实发育前期,整体呈先增加后降低的趋势,草酸、酒石酸含量逐渐降低,而柠檬酸含量逐渐升高。与‘四月李’相比,‘蜂糖李’果实中苹果酸、草酸、酒石酸及总酸含量的变化趋势与之一致,且苹果酸及总酸含量在整个过程中均显著低于‘四月李’,而柠檬酸含量的变化趋势与之相反。最后通过分析苹果酸含量与相关代谢酶活性之间的相关性,表明‘蜂糖李’果实中苹果酸在果实发育前期大量积累主要是该时期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性增强促进了苹果酸的大量合成以及NADP-苹果酸酶(NADP-ME)活性降低减少苹果酸的分解,与NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)关系不大,而‘四月李’苹果酸积累的关键酶是NAD-MDH。在果实发育后期,‘蜂糖李’及‘四月李’NADP-ME活性迅速升高,前者PEPC活性减弱,后者NAD-MDH活性下降,使得2者果实中苹果酸的降解大于合成而呈降低趋势。【结论】‘蜂糖李’是以苹果酸为主要有机酸的低酸型李品种,其果实中苹果酸积累的关键时期为果实发育前期,苹果酸含量的变化由PEPC和NADP-ME协同调控,而对照‘四月李’由NAD-MDH和NADP-ME起主要的调控作用。     

Flag-ALD融合载体构建及蛋白表达

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是感染鱼类的最常见致病菌之一，为了解维氏气单胞菌中丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase，ALD，EC 1.4.1.1）的调控功能，笔者通过分子克隆获得 Flag-ALD 融合表达载体，并在大肠杆菌中大量表达该蛋白。即以维氏气单胞菌C4基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增获得N端带有Flag标签的ald基因，将带有标签的目的基因与原核表达载体pACYCDuet连接，并将重组质粒pACYCDuet-Flag-ald 转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中。添加异丙基?β?D?1?硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导重组蛋白大量表达。SDS-PAGE分离与Western blot结果表明，来源于维氏气单胞菌的Flag-ALD重组蛋白在E.coli中以可溶性形式成功表达。本实验构建的Flag标记靶标蛋白可为研究丙氨酸脱氢酶在维氏气单胞菌中的功能以及在生物抑菌剂方面的应用提供技术支持。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

谷子MDH基因非生物逆境响应特性研究

为揭示谷子MDH基因对逆境胁迫的响应,本研究通过序列比对得到2个谷子苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)基因SiMDH1、SiMDH2,并对SiMDH1和SiMDH2的编码蛋白特征、基因结构、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,用荧光实时定量PCR(qPCR)检测了SiMDH1和SiMDH2在苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫和不同光照强度下的表达。蛋白特征参数和序列分析表明,SiMDH1和SiMDH2蛋白特征参数相似度很高,序列非常保守,都含有MDH基因的特征功能域苹果酸酶NAD结合域和苹果酸酶C端功能域。亚细胞定位预测显示,SiMDH1和SiMDH2主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体。启动子区域顺式元件分析发现,在SiMDH1和SiMDH2启动子区域含有大量光应答、激素类和其他类应答元件。苗期逆境qPCR表达谱分析发现,SiMDH1和SiMDH2受脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、高盐和低温不同程度诱导,揭示SiMDH1和SiMDH2参与了谷子苗期非生物逆境胁迫应答。进一步分析发现,SiMDH1和SiMDH2参与了谷子在拔节、抽穗、灌浆期的干旱应答,而光照强度会显著影响SiMDH1和SiMDH2基因在不同生育期的表达。本研究为进一步分析MDH逆境应答机制以及利用基因工程方法改善作物抗逆性提供了试验和理论支持。