十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物，建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法，并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示，此方法最适反应温度为64.4℃，优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应；与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应；具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内，结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点，为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择，有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种，国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月，某养殖场褐龙斑出现急性死亡，10 d内累积死亡率高达80%。现场调查发现，病鱼外观无明显异常，但反应迟钝，伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现，各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 µm的肿大细胞。超薄组织切片中发现，肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150 nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物，从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus, RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)基因1362 bp的全长编码区，构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树，结果显示，该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征，揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主，为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

用于水生病原菌的3种高通量活菌计数方法的比较

以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为研究对象，比较了MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数，确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示，副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据，活菌数的对数(LgC)与LgOD555 nm线性关系的标准曲线为LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，相关系数R²=0.9965，线性检测范围为7.8×106~2.5×108 CFU/ml；ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据，LgC与LgRUL线性关系的标准曲线为LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，相关系数R²=0.9994，线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml；高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据，LgC与Ts线性关系的标准曲线为LgC=?(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，相关系数R²=0.9924，线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明，ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性，MTT比色法准确度稍差，而高通量生长曲线法有最宽的线性范围，也最适合高通量测定。     

青岛文昌鱼自然保护区营养盐时空分布特征及富营养化评价

本研究分析了2017年9月(夏季)和11月(秋季)青岛市文昌鱼(Branchidermus fasciatus)水生野生动物市级自然保护区营养盐含量的季节变化和平面分布,并对该海域进行了富营养化评价。研究结果显示,2017年溶解无机氮(DIN)平均含量夏季高于秋季,NO_(2-)N、NH_(4-)N平均含量分别是秋季的1.98倍、1.44倍,而NO_(3-)N和PO_(4-)P平均含量低于秋季,分别是秋季的88.8%和47.6%。夏季DIN总体水平优于海水一类标准值,PO_(4-)P总体水平优于海水一类标准值;秋季DIN总体水平优于海水一类标准值,PO_(4-)P总体水平劣于海水一类标准值。从水平分布来看,夏季海水的DIN浓度分布趋势大致呈核心区实验区缓冲区的趋势;秋季海水的DIN浓度分布呈缓冲区实验区核心区。夏季N/P比值略高于Redfield比值,而秋季N/P比值较低于Redfield比值,DIN相对缺乏。根据潜在性富营养化评价模式,2017年保护区海域夏季和秋季营养水平较低,均属于贫营养水平。     

长山列岛邻近海域春、秋季鱼类群落结构

为探究长山列岛邻近海域春、秋季鱼类群落的空间格局, 根据 2016 年 10 月、2017 年 5 月在长山列岛邻近海域获取的渔业资源与环境调查数据, 应用聚类分析和非度量多维标度分析等多元统计分析方法研究了该海域春季、秋季鱼类群落空间结构及其与环境因子的关系。结果表明, 该海域春、秋季调查共获鱼类 66 种, 隶属于 11 目 33 科 58 属, 其中春季 46 种, 秋季 52 种, 均以鲈形目(Perciformes)为主。春季的优势种为黄鮟鱇(Lophius litulon)、 方氏云鳚(Enedrias fangi)和大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)等; 鱼类群落在空间上可分为 2 个站位组, 站位组Ⅰ位于长山列岛以西, 站位组Ⅱ位于长山列岛附近及其东部海域; 底层水温是影响春季鱼类群落空间结构的主要环境因素; 各站位组内的主要典型种如黄鮟鱇和赤鼻棱鳀(Thryssa kammalensis)等存在明显的空间分布差异。秋季的优势种为小眼绿鳍鱼(Chelidonichthys spinosus)、黄鮟鱇和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)等; 鱼类群落在空间上可分为 2 个站位组, 站位组 I 位于远离长山列岛的东部及西部海域, 站位组 II 则围绕长山列岛分布; 水深和底层水温是影响秋季鱼类群落空间结构的主要环境因素, 黄鮟鱇、褐牙鲆和许氏平鲉(Sebastes schlegelii)等主要典型种存在着围绕长山列岛分布的趋势。在水温的驱动下春季各站位组的主要典型种空间分布不同, 鱼类群落空间结构表现出较强的异质性; 秋季由于主要典型种的空间分布差异而呈现出环长山列岛和远离长山列岛的鱼类群落空间格局。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

黄河口近岸海域鮻渔业生物学特征研究

为探究黄河口近岸海域鮻(Liza haematocheila)的渔业生物学特征及资源状况,本研究根据2020年4—11月黄河口渔业生产定置网的采样数据,研究了黄河口水域重要渔业种类鮻群体的体长体重分布、体长–体重关系、繁殖、生长和死亡等渔业生物学特征和开发率。结果显示,鮻体长分布范围为45~460 mm,优势体长组为55~185 mm;体重范围为2~1100 g,优势体重组为2~80 g。方差分析表明,鮻的平均体长、体重均存在显著的月间差异;各月及全年鮻的体长–体重关系均呈显著的幂函数关系,生长类型为负异速生长。黄河口近岸海域,鮻在7月肥满度最大,而6月最小;产卵盛期为4—5月。鮻的生长速率为0.31 a?1,总死亡系数为1.42 a?1,自然死亡系数估算结果为0.51 a?1,捕捞死亡系数为0.91 a?1,其开发率为0.64,鮻种群资源被过度利用。定置网渔业生产对于黄河口渔业资源有一定的破坏作用,尤其对幼鱼和补充群体资源影响较大,应对定置网渔业生产采取必要的管理措施。     

许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道微生物群结构特征

采集常规饲养的健康许氏平鲉1日龄仔鱼,9、20日龄稚鱼,54、95日龄幼鱼,运用Illumina MiSeq PE300平台,对其肠道微生物的16S rDNA V3~V4可变区进行高通量测序,共获得1039个运算分类单位、667个属。在丰度高于1%的菌属水平上,野生鱼肠道菌群丰度的平均值(86%)远高于幼鱼时期的平均值(73.5%)。不动杆菌属为仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中最优势菌属(丰度为26.2%~45.3%);短芽孢杆菌属次之。结合共有菌属分析获得11个核心菌群,芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属等的丰度随仔鱼、稚鱼、幼鱼生长先升后降,均在54日龄时丰度最高;弧菌属则呈现相反的趋势(0.37%~12.41%),54日龄时丰度最低。仔鱼、稚鱼、幼鱼与野生个体肠道仅有14个共有菌属,短芽孢杆菌属、Massilia的最小丰度值分别是野生个体肠道中最大丰度值的9倍和32倍,差异明显。本研究揭示了许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群结构特征及其发生、发育的过程,为苗种繁育阶段肠道生理健康调控提供理论依据。     

崂山近岸浮游植物群落结构季节变化及其环境影响因素

为了解山东省青岛市崂山近岸海域浮游植物群落结构变化特征及其与环境因子的关系，于2016~2017年的春、夏、秋3个季节在该海域设置15个监测站位进行调查，并同步监测海区环境因子。结果显示，共检出浮游植物2门31属69种。其中，硅藻门(Bacillariophyta)为绝对优势门类，共25属60种，甲藻门(Pyrrophyta)有6属9种。调查海区浮游植物细胞丰度变化范围为(732.10~ 1142.19)×104 cell/m3，平均为937.15×104 cell/m3。浮游植物细胞丰度季节变化明显，2016年最高峰出现在秋季；2017年最高峰出现在夏季；空间分布上，春、夏2个季节呈现由北向南递减的趋势。浮游植物群落结构特征指数分析结果显示，调查海域浮游植物的多样性指数和丰富度指数均较好，表明该海域浮游植物群落结构比较稳定。聚类分析结果显示，春季浮游植物细胞丰度季节变化不大，2016和2017年相似性高达70%左右，但夏、秋季的浮游植物细胞丰度季节变化较大，相似性仅为40%左右，这主要与环境因子变化有关。浮游植物群落结构与环境因子相关性分析表明，浮游植物细胞丰度平均值与化学需氧量(COD)的相关系数最高，最高值为0.536，其次与之相关的双因子组为pH与COD、COD与无机氮(DIN)、溶解氧(DO)与COD。因此，崂山近岸海区浮游植物细胞丰度的关键限制因子为COD、pH、DIN和DO。