卵黄抗体对凡纳滨对虾生长、免疫及抗VpAHPND感染的影响

为探讨特异性卵黄抗体抗致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease, VpAHPND) 感染的效果及其机制,防控对虾急性肝胰腺坏死病 (Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND),本研究以添加不同剂量VpAHPND卵黄抗体制剂 (0、0.2%和0.5%) 的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,测定对虾的生长率和存活率、对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因相对表达水平,通过浸浴感染实验测定免疫对虾抗VpAHPND感染的能力。生长实验结果显示,免疫28 d后,免疫组与未添加卵黄抗体制剂的对照组对虾在平均生长率、特定生长率和存活率方面均无显著性差异。免疫功能实验结果显示,免疫14 d后,与对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的酚氧化酶 (PO)、超氧化物歧化酶 (SOD)、溶菌酶 (LZM) 活力显著升高,抗菌肽 (Crustin) 基因的相对表达水平也显著升高,而β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白 (β-GBP-HDL) 基因的相对表达水平则显著降低。浸浴感染实验结果显示,0.2%免疫组对虾的存活率显著高于对照组;0.2% VpAHPND卵黄抗体制剂对凡纳滨对虾的相对免疫保护率为63.77%。研究表明,口服卵黄抗体不会对凡纳滨对虾的生长和存活产生不良影响,0.2%的VpAHPND卵黄抗体制剂通过提升凡纳滨对虾的PO、SOD、LZM活力和Crustin基因表达水平,增强凡纳滨对虾的免疫功能,从而提高对虾抗VpAHPND感染的能力,具有很强的应用潜力。本研究为使用特异性卵黄抗体防控AHPND提供了依据,也为其作用机制研究提供了参考。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

低鱼粉饲料中添加低分子水解鱼蛋白对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗氧化能力的影响

以鱼粉水平为30%的饲料为高鱼粉饲料对照组，以豆粕替代高鱼粉饲料中50%鱼粉形成低鱼粉基础饲料，低鱼粉基础饲料添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%低分子水解鱼蛋白，配制 6种实验饲料，对初始体重为(0.44±0.02) g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾进行48 d的养殖实验。实验结束后采集样品，测定肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和丙二醛(MDA)含量，并分析肠道先天免疫缺陷基因(IMD)、对虾素3a分子(Penaiedin 3a)、溶菌酶(LZM)和Crustin相关免疫基因的表达量，以探讨低分子水解鱼蛋白对凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗氧化能力的影响。结果显示，在低鱼粉饲料中添加适宜水平的低分子水解鱼蛋白能够显著提高对虾肝胰腺T-SOD、AKP和ACP的活力，降低MDA的含量；且1.5%低分子水解鱼蛋白能增加IMD、Penaiedin 3a、LZM和Crustin基因表达量。综上，凡纳滨对虾非特异免疫力和抗氧化能力的降低可能是影响植物蛋白源替代鱼粉的关键原因之一，而在饲料中补充1.0%–1.5%的低分子水解鱼蛋白可有效提高凡纳滨对虾抗病相关基因的表达量，增强其非特异免疫力和抗氧化能力。     

聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾肝胰腺免疫和消化指标的影响

以平均体质量为(5.66±0.14)g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,分别投喂含聚β-羟基丁酸酯(PHB)质量分数为0%(对照组)、1%、3%和5%的对虾配合饲料,饲养35 d后检测并比较不同水平PHB对凡纳滨对虾肝胰腺免疫和消化指标的影响。结果显示,3%PHB添加组凡纳滨对虾的总抗氧化能力和溶菌酶活性显著高于对照组(P0.05)。Toll基因表达量随PHB含量的升高呈先上升后下降趋势,其中1%和3%PHB添加组的表达量显著高于对照组(P0.05);对照组HSP70基因表达量显著低于其他处理组(P0.05)。5%PHB添加组的淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活性显著升高(P0.05),而脂肪酶活性无显著变化(P0.05)。由此可见,饲料中添加适量的PHB有利于增强凡纳滨对虾肝胰腺的消化和非特异性免疫能力。     

凡纳滨对虾AP-1基因的克隆和表达特征分析

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明,该基因在凡纳滨对虾各组织中广泛表达,其中在血细胞中表达量最高。在WSSV感染早期(0.5 hpi),该基因表达没有显著改变,感染后5 h(5 hpi),AP-1基因开始显著上调表达,在人工感染后24 h,该基因的表达量达到最高(P0.01)。研究表明,该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,为进一步研究LvAP-1在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬与免疫相关因子基因表达的影响

在水温27～29℃下,将平均体长7.01 cm的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei饲养在730 mm×530 mm×450 mm的水族箱中,每箱30只,盐度6、18和30,每个盐度组3个平行,饲养6周,探讨盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬与免疫相关因子基因表达的影响。结果表明:盐度30和18组凡纳滨对虾血细胞吞噬活性显著高于盐度6组对虾(P0.05),盐度18组血细胞吞噬活性最高。30和18盐度组凡纳滨对虾肝胰腺中Toll样受体(TLR)、免疫缺陷基因(immune deficiency,IMD)、酚氧化酶(PO)、过氧化氢酶(CAT)及溶菌酶(LZM)基因表达水平显著高于盐度6组(P0.05);18盐度组凡纳滨对虾血细胞中TLR、IMD、PO、SOD及LZM基因表达显著高于6盐度组(P0.05);盐度30组对虾的TLR基因表达水平显著高于盐度18组(P0.05),而盐度30组对虾的PO和CAT基因表达水平显著低于盐度18组(P0.05);其他免疫因子基因的表达水平没有显著性差异。综上,环境中盐度的变化可能通过影响凡纳滨对虾各组织的抗氧化能力、溶菌活性、识别能力和血细胞吞噬活性等,调控凡纳滨对虾细胞和体液免疫。     

聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)非特异性免疫力及氨氮胁迫后免疫基因表达量的影响

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,探讨饲料中添加聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate, PHB)对其非特异性免疫能力的影响。采用单因子浓度梯度法,在基础饲料中分别添加1.0%、2.5%和5.0%的PHB配制成实验饲料,饲喂21 d后测定对虾免疫酶活性,选择最佳浓度组与空白对照组进行氨氮胁迫实验,测定对虾丙二醛(MDA)含量,同时利用RT-PCR技术测定氨氮胁迫48 h内对虾免疫基因表达水平,观察PHB对免疫基因表达量的影响。结果显示,总抗氧化能力(T-AOC)随PHB浓度升高呈现先上升后下降的趋势,血液、肝胰腺及鳃丝中T-AOC分别在2.5%、2.5%及1.0% PHB浓度时达到最高;PHB对肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活力无显著影响,血淋巴及鳃丝中SOD活力在最高浓度组(5.0% PHB)与对照组之间差异显著(P<0.05);过氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)在鳃和肝胰腺中的活力于PHB浓度为1.0%和2.5%时达到最高,其中POD相对于对照组分别提高了7.63倍和0.68倍,LZM活力分别提高了0.88及0.18倍。氨氮胁迫实验结果显示,对虾经PHB饲喂后,体内免疫基因表达量高于对照组,且体内MDA含量低于对照组。综上结果说明,PHB能提高凡纳滨对虾非特异性免疫能力。     

副溶血弧菌对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性和基因表达的影响

为了研究致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺抗氧化酶活性及相关基因表达的影响,本研究选取始体重(2.20±0.24)g的健康凡纳滨对虾初270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/m L和5×107 CFU/m L剂量的致病性副溶血弧菌对凡纳滨对虾进行浸浴攻毒实验。在实验第6小时、12小时、24小时和36小时取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P0.05),而过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性随感染时间的增加呈现先上升后下降的趋势,CAT活性于第12小时达到最大值,而GSH-PX和GST分别在第6小时和第24小时达到最大值,此结果表明副溶血弧菌感染对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性有显著影响,对其机体免疫防御系统有明显的破坏作用。Rab蛋白基因(Rab)和干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(Grim-19)表达水平显著高于对照组(P0.05),抗菌肽crustin和酚氧化酶原基因(Pro PO)的表达水平呈现先升高后降低趋势,分别在第12小时和第24小时达到最大值,分别为11.4倍和28.2倍,而GST基因表达水平在第12~36小时显著低于对照组(P0.05)。m TOR信号通路中真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP)基因的表达水产显著高于对照组(P0.05),真核细胞翻译启动因子1(e IF4E1A)和真核细胞翻译启动因子2(e IF4E2)基因的表达水平呈现先升高后降低的趋势,分别在第12小时和第6小时达到最大值,分别为2.6倍和1.6倍,核糖体S6蛋白激酶基因(P70s6k)的表达水平显著低于对照组(P0.05)。上述结果表明,凡纳滨对虾感染致病性副溶血弧菌后,肝胰腺抗氧化酶活性及免疫相关基因的表达均受到显著影响。     

凡纳滨对虾热休克蛋白90基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究咪唑类物质KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机理,克隆出HSP90全基因序列,采用real-time PCR法研究该基因的时空表达状况。将体长3.5～5.0cm的凡纳滨对虾幼虾随机分成2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡1min后,在相同条件下常规饲养。试验结果显示,凡纳滨对虾HSP90开放阅读框为2160bp,编码720个氨基酸,包含HSP90家族的保守序列。HSP90在凡纳滨对虾脑、肌肉、眼柄和肝胰腺中均有表达,其中肝胰腺中的表达水平较高。KK-42处理后,肝胰腺中HSP90mRNA水平升高69.1%以上(P0.05),其中第2d和3d,mRNA含量分别升高了505.5%和481.7%(P0.01)。结果表明,KK-42能诱导凡纳滨对虾肝胰腺HSP90的表达,这可能是KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机制之一。     

美人鱼发光杆菌对凡纳滨对虾非特异性 免疫功能及抗病力的影响

在基础饲料中分别添加0.1%和1%美人鱼发光杆菌灭活菌、0.1%美人鱼发光杆菌活菌配制成3种免疫实验饲料,以基础饲料为空白对照组饲料,每组设3个平行样。对个体质量为(4.83±0.36)g的凡纳滨对虾进行为期20 d的饲养实验,分别在0、5、10、15和20d进行取样,以血清中的酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(UL)活性为免疫指标,探讨了美人鱼发光杆菌作为免疫制剂对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的影响;在投喂免疫饲料后的第22天,按0.004 2 kg/kg体重的剂量,直接投喂对虾白斑综合征病毒(WSSV)病料,并记录累积死亡率。结果表明,美人鱼发光杆菌免疫实验组对凡纳滨对虾血清中PO、ACP、AKP、UL和SOD活性影响明显高于对照组,并且在饲料中添加美人鱼发光杆菌后,明显提高了对虾抵御WSSV感染的能力。其中0.1%美人鱼发光杆菌活菌实验组的抗病毒感染能力最强,WSSV感染14d内累计死亡率为63.3%±5.8%;而对照组为96.7%±3.3%。研究表明,美人鱼发光杆菌添加在对虾饲料中能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平,增强抵抗疾病的能力,将其作为对虾免疫增强剂具有良好的应用前景。     

Rotifer cellular membranes bind to white spot syndrome virus (WSSV)

Cell membranes from the rotifer, Brachionus urceus, were obtained by centrifugation and found to specifically bind white spot syndrome virus (WSSV) in vitro. This finding suggests that there is likely a WSSV receptor on the rotifer cell membrane and provides evidence that rotifers may be a host for WSSV.     

低盐水体南美白对虾与鲢鳙鱼混养的试验

在6口低盐淡水(盐度2～10)池塘中放养体长0 8～1 0cm的南美白对虾(Penaeusvan namei)(30万尾/hm2),其中三口塘再放养鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysno bilis)夏花(体长2 0～3 0cm)(1500尾/hm2,鲢:鳙=1:1)。鱼、虾分别精养90d和60d。混养池塘中对虾的成活率(24 6%)为单养池(9 1%)的2 7倍,产量(800 0±86 7)kg/hm2为单养池的3 2倍;鱼产量为(93 9±7 9)kg/hm2,鳙的出塘规格大于鲢,产量高于鲢。混养池塘水中氨氮、亚硝态氮和溶解氧含量低;透明度和活性磷含量高;pH值波动幅度小。     

对虾白斑综合症（WSS）的分子流行病学研究进展

本文主要依据1993年以来关于白斑综合症(WSS)的研究结果,对白斑综合症的致病因子与暴露、生物标志与生物学效应、易感性、预防策略进行综合评述,以期为有效控制WSS疫情、重振对虾养殖业提供参考。     

白斑综合征病毒(WSSV)3种PCR检测方法的灵敏度比较

为了探讨不同PCR检测方法的灵敏度,分别利用TaqMan实时定量PCR、世界动物卫生组织(OIE)公布的巢式PCR引物(简称OIE)、黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室(GB)设计的引物(简称GB)及2种巢式PCR对应的一步法PCR,对具有不同白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)含量的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)样品进行检测.结果显示,当使用已知病毒含量的标准品进行检测时,TaqMan实时定量PCR方法可以检测到l0个WSSV拷贝;OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法分别可检测到104和103个WSSV拷贝;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增时,分别可检测到5×104和2.5×104个WSSV拷贝;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物进行一步法PCR扩增时,分别可检测到104和5×103个WSSV拷贝.使用上述PCR方法分别对44份未知WSSV含量的样品进行验证,定量PCR方法检测阳性率为84.09%,OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法检测的阳性率分别为18.18%和27.27%;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率均为15.91%;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率分别为18.18%和20.45%.根据以上结果,PCR方法检测WSSV的灵敏度由高到低依次为:定量PCR、巢式PCR、一步法PCR.     

白斑综合征病毒(WSSV)在拟穴青蟹体内增殖的研究

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)因肉质鲜美、生长快速而成为我国主要的海水养殖经济蟹类,但是随着养殖规模的不断扩大,病害问题也越发严重。本研究通过流行病学调查和定量PCR跟踪检测的方法,研究了拟穴青蟹对白斑综合征病毒(WSSV)的易感性和WSSV在拟穴青蟹体内的增殖情况。结果表明,拟穴青蟹是WSSV的自然宿主,自然携带率为8.47%。WSSV可通过口服途径感染拟穴青蟹,并在拟穴青蟹体内快速增殖,注射感染5 d后,病毒量达到感染1d时的1.1×109倍,当病毒累积到一定量后即可致死拟穴青蟹。研究表明,拟穴青蟹是WSSV的天然宿主,在虾蟹混养过程中可以通过摄食WSSV感染虾而带毒或发病,并因此成为WSSV传播媒介,从而对虾蟹混养条件下WSSV的防治效果产生重要影响。     

对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性

应用克氏原螯虾作为动物模型研究对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）的感染增殖特性，涉及感染温度，感染途径，继发感染，半数致死量（ＬＤ５０），免疫保护及保存期等，结果显示，２２－２５℃时，接种ＷＳＳＶ的螯虾一般于２－７d内死亡，温度升高对病毒增殖影响不显著，３０－３２℃时，平均死亡时间２－６d，温度降低对病毒增殖影响较显著，１５－１９℃时，接种螯虾平均２－１０d内死亡，８－１０℃时，平均死亡时间３－６d，感染途径分别用腹节肌肉，腹节皮下洲射及口服，均能使螯虾感染发病，而浸泡方式不能使螯虾发病，细菌分离和细菌定量结果表明，寄考于螯虾心脏，肝胰腺内的阴沟肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是正常螯虾的２５和３０倍，形成继发感染，用螯虾心脏，肝胰腺内的阴肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是政党螯虾的２５和３０倍，形成继发梁。用螯虾测定ＷＳＳＶ的ＬＤ５０为１０^-6.5.mL^-1种毒液，将病毒５６℃，３０min灭活后免疫螯虾，不能使螯虾形成免疫保护，ＷＳＳＶ匀浆液－３０℃冻存１年后失活，而－３０℃冻存于螯虾体内ＷＳＳＶ保存１年后仍有活力。     

斑石鲷irf7基因克隆及其在病毒感染下的表达

为探究斑石鲷(Oplegnathus punctatus)干扰素调节因子irf7在虹彩病毒(Iridovirus)感染过程中的作用机制,本研究通过PCR扩增获得了斑石鲷irf7基因CDS区序列,对其序列特征进行分析,并在组织水平和细胞水平研究该基因在病毒感染中的表达模式。结果显示,Opirf7基因CDS区全长为1332 bp,编码443个氨基酸的多肽,具有干扰素调节因子家族的保守结构域。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,Opirf7基因在健康个体的不同组织中均有表达,在肝脏中表达量最高,在皮肤和肠等免疫组织中的表达量也较高。对斑石鲷腹腔注射虹彩病毒诱导抗病毒免疫反应,在组织水平检测Opirf7对病毒感染的响应模式。与对照组(0 h)相比,Opirf7在免疫组织中的表达水平有不同程度的升高。在细胞水平,建立poly I: C感染的斑石鲷脑细胞系模型,利用qRT-PCR检测Opirf7的表达变化。结果显示,poly I: C刺激后,脑细胞系Opirf7的表达量显著升高。结果表明,Opirf7在斑石鲷抗病毒病的免疫应答过程中发挥重要作用。     

Competition of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) with white spot syndrome virus (WSSV) for binding to shrimp cellular membrane

Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) and white spot syndrome virus (WSSV) are two widespread shrimp viruses. The interference of IHHNV on WSSV was the first reported case of viral interference that involved crustacean viruses and has been subsequently confirmed. However, the mechanisms underlying the induction of WSSV resistance through IHHNV infection are practically unknown. In this study, the interference mechanisms between IHHNV and WSSV were studied using a competitive ELISA. The binding of WSSV and IHHNV to cellular membrane of Litopenaeus vannamei was examined. The results suggested that there existed a mutual competition between IHHNV and WSSV for binding to receptors present on cellular membrane of L. vannamei and that the inhibitory effects of WSSV towards IHHNV were more distinct than those of IHHNV towards WSSV.     

西藏当曲河的鱼类

1980年7月上旬在西藏拉萨河上游支流当曲河进行调查，采集到鱼类标本113号，经鉴定为6种和1种自然杂交鱼类。     

鱼体内环境激素DMP和DEP的检测方法

建立同时检测鲫(Carassuys auratus Linnaeus)血浆和肌肉中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和邻苯二甲酸二乙酯(DEP)的高效液相色谱方法,进行初步的代谢动力学研究。血浆样品经液-液萃取,肌肉样品经液-液萃取和固相小柱处理后,以乙腈∶水=40∶60(V/V)为流动相,流速1.0mL/min,采用SHIMADZU ODS柱(150mm×4.6mm;i.d.,5μm)色谱柱分离。测定鲫经口染毒后血浆和肌肉中DMP和DEP的浓度。结果表明,标准曲线线性范围为0.05~10.0μg/mL,线性关系良好(r>0.99),定量限为0.05μg/mL,回收率95%以上,日内变异系数和日间变异系数均低于15%。经口染毒48h内,鲫血浆和肌肉中均能检测到DMP和DEP的残留。该法操作简便、快速、灵敏、准确,已经初步用于鲫血浆和肌肉中DMP和DEP的代谢动力学和残留研究。