斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

厚壳贻贝5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)基因克隆和时空表达

为探究5-羟色胺2A受体（5-HT 2A receptor， 5-HT2AR）基因在海水贝类生长发育中的作用，本研究通过RACE技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）克隆了厚壳贻贝5-HT2AR 基因的cDNA全长，并分析该基因的时空表达。结果显示，5-HT2AR基因全长2 636 bp，开放阅读框（ORF）2 124 bp，共编码707个氨基酸。序列分析结果显示该序列与人、小鼠、斑马鱼、长牡蛎和虾夷扇贝等物种分别具有45%、45%、48%、49%和67%的同源性。厚壳贻贝雌雄成体各组织和器官中均有5-HT2AR基因表达，雄性中的鳃表达量最高，而在雌性鳃、外套膜和性腺中的表达稍高于其他组织和器官；推测该基因可能与厚壳贻贝的摄食、对外界环境的感知及促进卵母细胞成熟有关。5-HT2AR基因在厚壳贻贝各发育阶段均有表达，且稚贝的表达量为眼点幼虫的1.4倍，推测5-HT2AR基因可能参与了调控厚壳贻贝幼虫的生长发育过程。本研究为进一步了解5-HT基因家族在双壳贝类中的功能奠定了基础。     

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析.结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6h后显著升高(P<0.05),表明md2表达量升高可能活化P53;8℃、6h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大.研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一.     

鱼类应激应对策略及其在抗逆育种中的应用

发展现代水产种业，引领水产养殖绿色发展，成为未来水产养殖业可持续发展的保障。应鼓励产业选育推广优质、高效、多抗、安全的水产养殖新品种，由单纯高产品种转向适宜生态化、集约化养殖模式的优质高效、节料节药、抗逆性强、适应性广的品种。本文分析了当前水产种业存在的一些问题，剖析了优质、高效、多抗水产养殖品种的耐应激本质，围绕应激反应、应激恢复、应激应对方式在畜禽种业中的应用案例等，提出了环境限制育种理念和未来综合性抗逆育种技术发展方向，助推水产养殖业的可持续发展。     

复合垂直流人工湿地植物与基质层微生物群落特征比较分析

为了解复合垂直流人工湿地系统对海水养殖尾水中各形态氮的处理效果, 以及植物与不同基质层微生物群落特征的相似性和差异性, 以互花米草(Spartina alterniflora)-细砂-煤渣-碎石构建的复合垂直流人工湿地系统为研究对象, 研究了该系统对海水石斑鱼养殖尾水中 COD、NO₃ ^– -N、NO₂ ^– -N、NH₄ ⁺ -N 和总氮(TN)的去除效果, 并采用高通量测序技术分析了植物根际和不同基质层微生物群落特征。结果表明, 复合垂直流人工湿地系统对污染物有较好的去除效果, 出水中 COD、NO₃ ^– -N、NO₂ ^– -N、NH₄ ⁺ -N 和 TN 的平均浓度分别为 4.00 mg/L, 0.15 mg/L, 0.16 mg/L, 0.04 mg/L, 0.64 mg/L。植物根际样品和细砂层样品的微生物群落丰富度和多样性较高, 与其他基质层样品具有明显差异; 在门分类水平上优势菌以变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和厚壁菌门为主, 相对丰度分别为 53.7%、11.5%、11.9%、6.4%、3.7%; 在纲分类水平优势菌以 α-变形菌纲、γ-变形菌纲、放线菌纲和拟杆菌纲为主, 相对丰度分别为 30.1%、20.9%、11.9%、10.3%; 人工湿地中丰度最高的脱氮功能菌包括亚硝化单胞菌属、硝化螺菌属、 芽孢杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属; 系统中微生物代谢功能丰富, 且所有样品功能组成相似; 相同基质层样品的微生物群落组成差异较小, 二级湿地单元各基质层样品微生物群落的差异程度与一级湿地单元相比较小。     

维生素B7和B12对细菌生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探究B族维生素对海洋细菌生物被膜形成、海洋贝类幼虫变态所产生的作用,本研究首先使用维生素B7 (VB7)和B12 (VB12)直接刺激厚壳贻贝(Mytilus coruscus)幼虫,观察其对变态的直接诱导活性;然后通过添加VB7和VB12,与海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)共同形成生物被膜,分析B族维生素对生物被膜形成及其生物学特性的影响;同时检测生物被膜变化对厚壳贻贝幼虫变态发育的影响。研究结果显示,0.02 mmol/L浓度VB7和VB12可以直接诱导厚壳贻贝幼虫的变态,且效果最为显著(P<0.05);0.02 mmol/L浓度VB7和VB12处理后的海假交替单胞菌生物被膜对幼虫附着变态的诱导作用均显著提高(P<0.05);进一步通过细菌密度计数、膜厚度分析、可拉酸染色和定量等方法,揭示VB7和VB12处理后生物被膜细菌密度、膜厚度以及胞外多糖、蛋白和脂质均显著增加(P<0.05)。研究结果证实,VB7和VB12可能通过改变海洋细菌生物被膜的生物学特性,进而调控厚壳贻贝幼虫变态发育。本研究为探究厚壳贻贝幼虫附着变态的分子机制提供了新的理论依据和创新思路,同时为B族维生素在提高厚壳贻贝人工育苗技术、改善厚壳贻贝养殖产业问题和促进海洋牧场生态修复建设等方面的应用提供了理论基础。     

纤维素对海假交替单胞菌生物被膜生物学特性及厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为探究纤维素对海假交替单胞菌生物被膜的生物学特性及其对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响,实验设置海假交替单胞菌(初始细菌密度5×10⁸个/m L)分别与浓度为0.02、0.20、2.00、20.00 mg/L的纤维素共孵育形成生物被膜,检测形成的生物被膜对厚壳贻贝幼虫变态的诱导作用变化,比较生物被膜成膜能力、胞外产物等生物学特性变化,并分析其与厚壳贻贝幼虫附着变态的关系。纤维素浓度为2.00或20.00 mg/L时,所形成的生物被膜对幼虫附着变态的诱导活性显著降低。通过分析加入纤维素后海假交替单胞菌形成的生物被膜生物学特性发现,随着纤维素浓度升高,生物被膜中细菌的分布更为分散,细菌密度和膜厚呈逐渐降低趋势,生物被膜胞外产物中α-多糖、β-多糖和脂质的生物量显著降低,而蛋白无明显变化。在海假交替单胞菌生物被膜形成过程中,纤维素主要通过降低胞外α-多糖、β-多糖和脂质的产生,进而间接调控厚壳贻贝幼虫附着变态。研究结果为探究海假交替单胞菌纤维素对生物被膜形成及对厚壳贻贝附着变态调控分子机制提供理论依据,为整治生物污损等实际问题提供新思路。     

弧菌生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响

为探讨生物被膜动态演替过程中如何影响海洋无脊椎动物附着,实验选取了对厚壳贻贝附着具有不同诱导活性的弧菌Vibrio cyclitrophicus、V. chagasii和Vibrio sp. 22形成单一生物被膜,观察弧菌动态演替中生物被膜细菌密度、膜厚度和胞外产物等生物学特性变化,探究其对厚壳贻贝稚贝附着的影响。结果显示,弧菌生物被膜动态演替过程中,被膜细菌随着时间推移出现聚集现象,细菌密度和膜厚度也随着时间变化呈先增多后减少。除了Vibrio sp. 22,V. cyclitrophicus和V. chagasii生物被膜细菌密度和膜厚度与稚贝附着均有不同程度的相关性。所测弧菌生物被膜胞外产物的显微激光共聚焦结果分析发现,胞外多糖随着时间先增多,然后开始下降。相对比而言,胞外蛋白和胞外脂质无显著性变化。因而,胞外多糖变化规律与稚贝在被膜上附着变化相一致,表明胞外多糖是生物被膜动态演替过程中调控厚壳贻贝附着的重要因素。本实验初步探讨了生物被膜动态演替特征及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响,对于后续进一步在海区开展生物被膜的动态演替与海洋底栖动物附着相互关系研究具有重要的学术价值,同时对于人工鱼礁礁体生物附着机理的研究具有重要的实践价值。     

不同温度下形成的深海菌膜对厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探讨深海细菌生物被膜对温度的适应性及对厚壳贻贝幼虫变态的影响,分别在4、18、25、37°C条件下培养生物被膜,调查温度对细菌密度、膜厚和胞外产物等生物学特性的影响,以及被膜对幼虫变态发育的影响。结果显示,4个温度条件下产生的生物被膜均可有效促进幼虫变态发育。其中,深海菌株Virgibacillus sp. 1在18°C时生物被膜的变态诱导活性最高(35%),且α胞外多糖含量较高,诱导活性与温度和细菌密度均显著相关;同时温度与其细菌密度和膜厚均显著相关。2株深海假交替单胞菌诱导活性与细菌密度均显著相关,温度仅影响Pseudoalteromonas sp. 33细菌密度。研究表明,3株深海细菌均有很好的温度适应性,且都能形成生物被膜;温度变化导致生物被膜的生物学特性改变,最终影响其对幼虫的诱导效果。     

灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响

为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL 3个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,灿烂弧菌刺激48 h后,厚壳贻贝足、鳃、消化腺等组织中仅消化腺的NOS活性较对照组有显著升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度灿烂弧菌刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。研究表明,灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高有诱导作用,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。