脂多糖对细菌生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探究脂多糖(LPS)对海洋细菌生物被膜形成、海洋贝类幼虫变态所产生的作用,本研究使用不同浓度的LPS直接刺激厚壳贻贝幼虫,观察其对幼虫附着变态的直接作用;同时在海假交替单胞菌形成生物被膜的过程中添加不同浓度的LPS,通过分析生物被膜生物学特性的变化,及变化后的生物被膜对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响。研究结果显示,3种浓度的LPS均可直接诱导厚壳贻贝幼虫的变态;10 mg/L浓度LPS处理后的生物被膜其细菌密度、膜厚明显降低(p<0.05),胞外产物中多糖(如可乐酸)、脂类显著增加(p<0.05),同时其对幼虫变态的诱导作用也显著提高(p<0.05),因此推测,在厚壳贻贝幼虫的附着变态过程中,LPS具有直接诱导作用;除此之外,脂多糖还可以通过调控生物被膜胞外物质,特别是可乐酸的生成,从而间接影响厚壳贻贝幼虫的附着变态。     

纤维素对海假交替单胞菌生物被膜生物学特性及厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为探究纤维素对海假交替单胞菌生物被膜的生物学特性及其对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响,实验设置海假交替单胞菌(初始细菌密度5×10⁸个/m L)分别与浓度为0.02、0.20、2.00、20.00 mg/L的纤维素共孵育形成生物被膜,检测形成的生物被膜对厚壳贻贝幼虫变态的诱导作用变化,比较生物被膜成膜能力、胞外产物等生物学特性变化,并分析其与厚壳贻贝幼虫附着变态的关系。纤维素浓度为2.00或20.00 mg/L时,所形成的生物被膜对幼虫附着变态的诱导活性显著降低。通过分析加入纤维素后海假交替单胞菌形成的生物被膜生物学特性发现,随着纤维素浓度升高,生物被膜中细菌的分布更为分散,细菌密度和膜厚呈逐渐降低趋势,生物被膜胞外产物中α-多糖、β-多糖和脂质的生物量显著降低,而蛋白无明显变化。在海假交替单胞菌生物被膜形成过程中,纤维素主要通过降低胞外α-多糖、β-多糖和脂质的产生,进而间接调控厚壳贻贝幼虫附着变态。研究结果为探究海假交替单胞菌纤维素对生物被膜形成及对厚壳贻贝附着变态调控分子机制提供理论依据,为整治生物污损等实际问题提供新思路。     

不同温度下形成的深海菌膜对厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探讨深海细菌生物被膜对温度的适应性及对厚壳贻贝幼虫变态的影响,分别在4、18、25、37°C条件下培养生物被膜,调查温度对细菌密度、膜厚和胞外产物等生物学特性的影响,以及被膜对幼虫变态发育的影响。结果显示,4个温度条件下产生的生物被膜均可有效促进幼虫变态发育。其中,深海菌株Virgibacillus sp. 1在18°C时生物被膜的变态诱导活性最高(35%),且α胞外多糖含量较高,诱导活性与温度和细菌密度均显著相关;同时温度与其细菌密度和膜厚均显著相关。2株深海假交替单胞菌诱导活性与细菌密度均显著相关,温度仅影响Pseudoalteromonas sp. 33细菌密度。研究表明,3株深海细菌均有很好的温度适应性,且都能形成生物被膜;温度变化导致生物被膜的生物学特性改变,最终影响其对幼虫的诱导效果。     

细菌运动性对生物被膜的动态演替及其对厚壳贻贝附着的影响

为研究海洋细菌的运动性在生物被膜形成和贝类附着过程中的作用,本研究以厚壳贻贝(Mytilus coruscus)为研究对象,开展了海洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)野生型菌株和ΔcheW菌株不同时间段的运动性能分析,调查了运动性能不同的细菌形成生物被膜的膜厚、细菌密度以及胞外产物的动态变化,探究了其生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响。研究发现,野生型菌株和ΔcheW菌株在6、12、24、48、72和96 h等不同时间的运动性能差异显著(P<0.05)。同时,对2株菌株形成菌圈的半径进行测量发现,随着时间的变化,菌圈的半径不断增加,均在96 h达到最大。整体上,野生型菌株在不同时间段形成的菌圈大于ΔcheW菌株。在运动性的作用下,2株菌株随着时间的变化形成生物被膜的细菌密度及膜厚在48 h达到最大值,在72 h后开始扩散。在运动性的影响下,野生型菌株在不同时间段形成的生物被膜对厚壳贻贝附着诱导效果显著高于ΔcheW菌株。在运动性介导下,2株菌株形成生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着率随着时间变化呈现先增长后减少的趋势,在48 h达到最高,在72 h后开始降低,这一结果与不同时间段下形成生物被膜的胞外产物变化一致,且胞外产物分泌与细菌运动性密切相关。因此,运动性影响生物被膜的形成,且在生物被膜动态演替过程中介导了生物被膜的膜厚、细菌密度以及胞外产物的分泌,从而影响了厚壳贻贝的附着。本研究为后续开展细菌运动性、生物被膜形成和厚壳贻贝互作机制研究奠定了基础,为海洋经济物种的生产养殖提供了技术支撑。     

培养基对微生物被膜形成和厚壳贻贝附着的影响

为探讨微生物被膜生物学特性、培养基以及大型生物附着三者之间的相互关系,本实验通过微生物分子生态学和海洋贝类生态学等方法调查了不同培养基对海洋细菌所形成微生物被膜的影响及其对厚壳贻贝幼虫附着的影响。结果显示,厚壳贻贝稚贝率与培养基类型和细菌初始密度显著相关,进一步分析表明,Zo Bell 2216E和Seawater Luriabertani(SWLB)条件下分别有6株和9株细菌形成的微生物被膜密度与稚贝率显著相关。扫描电镜结果显示,Staphylococcus sp.3在Zo Bell 2216E培养基条件下形成微生物被膜的细菌分布较为紧密,Pseudoalteromonas sp.8则在SWLB培养基条件下微生物被膜细菌分布较为紧密,且形态变为短杆状。SDS-PAGE结果显示,相比Zo Bell 2216E培养基,Staphylococcus sp.3在SWLB培养基条件下9条条带蛋白显著下降,其中2个条带完全消失;Pseudoalteromonas sp.8则在SWLB培养基条件下明显增加5条蛋白条带。研究表明,微生物被膜的形成受到培养基的影响,培养基的不同导致微生物被膜的形态结构、分布和蛋白有所差异,最终导致微生物被膜诱导厚壳贻贝幼虫附着变态的活性差异,本研究为后续开展厚壳贻贝附着的分子机制奠定良好基础。     

硅烷化表面海洋细菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为探讨厚壳贻贝稚贝对自然微生物膜中海洋细菌的附着行为反应,本论文研究了厚壳贻贝（Mytilus coruscus）稚贝附着与硅烷基化附着基表面、微生物膜密度以及细菌种属系统发育之间的相互关系。研究表明所测海洋细菌均能显著促进厚壳贻贝稚贝的附着;其中Staphylococcus sp. 1和Cobetia sp. 1表现出较低诱导活性,且这两株细菌形成的微生物膜密度与稚贝附着率之间无显著相关性;其他7株海洋细菌均表现出中等程度诱导活性,且所形成的微生物膜密度与稚贝附着率之间呈显著相关性。系统发育分析表明所测海洋细菌对厚壳贻贝稚贝附着的诱导活性与细菌种属无关。因而,硅烷基化表面的海洋附着细菌对厚壳贻贝附着有着显著性促进作用,本研究将为后续开展厚壳贻贝稚贝附着机制奠定了基础。     

中湿度表面的海洋细菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为研究自然微生物膜中海洋细菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响,通过海洋贝类生物学、分子微生物生态学等手段调查附着基表面湿度、微生物膜的密度以及细菌种属系统发育与厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝附着关系。结果表明,所有测试海洋细菌形成微生物膜的最终密度随初始密度的增加而增加。所测海洋细菌均能不同程度地诱导厚壳贻贝稚贝的附着,其中Cobetia sp.3形成的微生物膜显示出最高诱导活性,其诱导的稚贝附着率为(70%±3%);Nautella sp.2、Pseudoalteromonas sp.9、Pseudoalteromonas sp.10、Bacillus sp.5和Pseudoalteromonas sp.11等5株细菌表现中等程度的诱导活性,其诱导的附着率范围为51%~60%。所有测试菌株所形成的微生物膜密度与稚贝附着均呈显著相关,尤其是Pseudoalteromonas sp.9和Cobetia sp.3诱导活性与附着率相关性极强,其相关性系数分别为0.774 1和0.723 3。系统发育分析结果表明,微生物膜密度和厚壳贻贝稚贝的附着率显著相关,然而海洋细菌诱导活性与细菌种属无关。因而,中湿度表面的海洋附着细菌对厚壳贻贝的附着有着明显的促进作用,本研究为后续开展厚壳贻贝稚贝的附着机制提供了理论依据。     

弧菌生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响

为探讨生物被膜动态演替过程中如何影响海洋无脊椎动物附着,实验选取了对厚壳贻贝附着具有不同诱导活性的弧菌Vibrio cyclitrophicus、V. chagasii和Vibrio sp. 22形成单一生物被膜,观察弧菌动态演替中生物被膜细菌密度、膜厚度和胞外产物等生物学特性变化,探究其对厚壳贻贝稚贝附着的影响。结果显示,弧菌生物被膜动态演替过程中,被膜细菌随着时间推移出现聚集现象,细菌密度和膜厚度也随着时间变化呈先增多后减少。除了Vibrio sp. 22,V. cyclitrophicus和V. chagasii生物被膜细菌密度和膜厚度与稚贝附着均有不同程度的相关性。所测弧菌生物被膜胞外产物的显微激光共聚焦结果分析发现,胞外多糖随着时间先增多,然后开始下降。相对比而言,胞外蛋白和胞外脂质无显著性变化。因而,胞外多糖变化规律与稚贝在被膜上附着变化相一致,表明胞外多糖是生物被膜动态演替过程中调控厚壳贻贝附着的重要因素。本实验初步探讨了生物被膜动态演替特征及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响,对于后续进一步在海区开展生物被膜的动态演替与海洋底栖动物附着相互关系研究具有重要的学术价值,同时对于人工鱼礁礁体生物附着机理的研究具有重要的实践价值。     

不同来源海洋弧菌微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为探讨广泛存在于近海环境中海洋弧菌和贝类附着的相互作用关系,实验从自然微生物被膜和厚壳贻贝成体肠道内分离了海洋弧菌,测定其种属及亲缘性,调查了这些不同来源弧菌形成的微生物被膜与厚壳贻贝稚贝附着的调控作用。结果显示,测试弧菌形成的微生物被膜密度随着初始细菌密度的增加呈现不同程度的增加。源于自然微生物被膜和贻贝肠道内的10株弧菌均能显著促进厚壳贻贝稚贝的附着,不同菌株形成微生物被膜的诱导活性存在显著差异,附着率变化范围为17%~67%,其中稚贝在Vibrio sp.17微生物被膜上的附着率为67%±2%。微生物被膜对稚贝附着诱导活性与被膜密度呈显著相关性,其中弧菌V.crassostreae ECSMB14106的相关性系数最高,为0.8992。此外,微生物被膜的诱导活性与弧菌的来源无关。本实验初步探明了海洋弧菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响,有助于进一步理解微生物被膜调控厚壳贻贝的附着分子机理。     

GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱和CGP52432对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为研究GABA及其受体拮抗剂荷包牡丹碱（GABA_A受体）和CGP52432 （GABA_B受体）在厚壳贻贝幼虫附着变态中的调控作用,实验通过分析厚壳贻贝不同发育阶段幼虫转录组数据获得GABA受体相关蛋白基因（GABARAP）和GABA_B2受体基因(GABA_B2R),发现GABA_B2R在变态前期的眼点幼虫阶段相较于其他阶段幼体显著高表达。通过实时荧光定量PCR验证也得到相似的表达模式,显示GABA_B2R可能参与调控厚壳贻贝幼虫变态发育。药理学实验结果显示,10^-4 mol/L GABA对厚壳贻贝幼虫的变态具有诱导活性（27.2%±3.0%）。在拮抗剂实验中,10^-6～10^-4 mol/L荷包牡丹碱和CGP52432均显著抑制了厚壳贻贝幼虫变态,且抑制作用随浓度升高而增强。实验还发现GABA及其受体拮抗剂都抑制了厚壳贻贝幼虫的游泳行为。研究表明,GABA_A或GABA_...     

胆碱受体化合物对厚壳贻贝幼虫变态的调控作用

为研究胆碱受体在厚壳贻贝幼虫变态发育过程中的作用,通过药理学手段调查胆碱类神经递质乙酰胆碱、氯甲酰胆碱及其拮抗剂六甲双铵和阿托品对厚壳贻贝幼虫变态发育调控作用。结果显示:在24 h暴露实验中,氯甲酰胆碱在10-5~10-4mol/L浓度表现出诱导活性,乙酰胆碱则无诱导活性。在持续暴露实验中,氯甲酰胆碱在10-5~10-4mol/L浓度表现出诱导活性,乙酰胆碱在10-6~10-4mol/L浓度表现出诱导活性。在拮抗剂实验中,在10-4mol/L氯甲酰胆碱或10-4mol/L乙酰胆碱存在时,N型胆碱受体拮抗剂六甲双铵对厚壳贻贝幼虫的变态均无抑制效果,表明N型胆碱受体可能并不在幼虫的变态发育过程发挥主导作用。M型胆碱受体拮抗剂阿托品在10-4mol/L氯甲酰胆碱存在时表现出抑制作用,且测试液中幼虫的变态率降为0%,表明M型胆碱受体可能参与调控厚壳贻贝幼虫变态发育过程。在整个药理学实验过程中无死亡幼虫出现,因而氯甲酰胆碱和乙酰胆碱可作为有效诱导物来促进厚壳贻贝幼虫的变态发育,尝试应用于该种的水产养殖过程;同时本研究为厚壳贻贝变态发育调控机制的研究提供有效理论依据。     

厚壳贻贝M7 lysin分子的克隆与表达

M7 lysin位于贻贝精子顶体中,是溶解卵黄膜、促进受精作用的重要蛋白质,决定了贻贝种间精卵识别的特异性。采用同源克隆法得到厚壳贻贝M7 lysin分子,并在原核生物中对该分子进行重组表达。结果表明,扩增产物为540 bp左右的片段,进一步测序发现其开放阅读框cDNA为543 bp,与贻贝、地中海贻贝、盖勒贻贝具有较高的相似性;在线翻译所得蛋白质片段中含有180个氨基酸,分子量为20 ku,等电点为8.48;通过M7 lysin氨基酸序列构建系统进化树发现,贻贝和地中海贻贝亲缘关系最近,其次为盖勒贻贝,最后是厚壳贻贝;将 M7 lysin分子在E.coli Rosseta(DE3)中融合表达,得到包括载体氨基酸序列在内的25 ku蛋白质,符合预期分子质量。     

厚壳贻贝早期幼虫低温保存的影响研究

探讨低温(4 ℃)条件下的厚壳贻贝早期幼虫保存可能性,同时调查了不同培育密度对低温保存的影响。在正常条件下,继续培育低温保存后的幼虫,并调查其存活率和生长的变化。 结果表明,在低温保存后,早期幼虫存活率较高,超过95%;厚壳贻贝早期幼虫的壳长和壳高出现显著性的增长。不同培育组间,培育密度对厚壳贻贝早期幼虫的存活和生长影响不同,表明密度是幼虫低温保存的一个重要因素。在正常培育条件下,低温保存后的幼虫,3周后其存活率明显低于对照组,但仍超过50%,且其生长速度明显高于对照组。因此,低温培育是保存厚壳贻贝早期幼虫的有效方法,可用于今后贝类幼虫生物学实验和人工育苗技术的改善研究。     

不同溶解氧水平下厚壳贻贝的贝壳开放行为和呼吸代谢

为了探讨溶解氧浓度变化对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)摄食和代谢的影响, 分析贝壳开放行为和呼吸代谢的相关关系, 观察测定了 8 mg/L、6 mg/L、4 mg/L、2 mg/L 和 1 mg/L 溶解氧水平下厚壳贻贝贝壳开放程度、滤水率、耗氧率和排氨率, 并计算了氧氮比值。结果显示, 溶解氧浓度在 4 mg/L 及以上水平时, 厚壳贻贝的贝壳持较大程度开放, 而当溶解氧浓度降至 2 mg/L 及以下后, 贝壳逐渐关闭; 溶解氧浓度降至 4 mg/L 后, 贻贝滤水率显著下降; 溶解氧浓度在 2~8 mg/L 间, 贻贝耗氧率无显著变化, 降至 1 mg/L 后, 耗氧率显著下降; 排氨率与滤水率和耗氧率呈相反趋势, 溶解氧浓度降至 2 mg/L 后, 贻贝排氨率显著上升; 降至 4 mg/L 后, 氧氮比值显著下降; 贝壳开放程度与滤水率、耗氧率之间呈正相关关系。研究表明, 厚壳贻贝可以适应一定范围内溶解氧浓度的波动, 保持机体代谢水平相对稳定; 当环境溶解氧降至 1 mg/L 以下, 机体无法再维持正常的代谢, 厚壳贻贝部分关闭贝壳, 以降低能量消耗, 应对低氧胁迫。本研究可为厚壳贻贝低氧适应机制研究和养殖提供参考。     

Effect of submerged time of collector ropes on the settlement capacity of Mytilus galloprovincialis L.

Submersion time of collector ropes influences settlement and larval metamorphosis of Mytilus galloprovincialis, which might be related to the biofilm development. In the present study, the effect of submersion time of collector ropes on the settlement of mussel seed was studied. The results of two experiments performed in an experimental long‐line in the Ría de Ares‐Betanzos have established a minimum submersion time of 41–46 days.     

Effect of temperature on survival,growth and development of Mytilus galloprovincialis larvae

Mussel aquaculture is widely prevalent worldwide, but generally relies on natural seed collection, which does not always meet the needs of the producers. Thus, development of mussel hatcheries is of economic interest in some parts of the world, such as Europe; it provides opportunities not only on annual reliability of seed but also on genetic improvements. To broaden knowledge on mussel larval physiology, we carried out temperature treatments (17, 20 and 24 °C) on Mytilus galloprovincialis larvae under laboratory conditions. The trials ended when 30% of the larval population was in the post‐larval stage. The temperature coefficient Q₁₀ indicated a strong relationship between temperature and increase in growth from 17 to 20 °C, but not between 20 and 24 °C. Exposure of M. galloprovincialis larvae to 17 °C resulted in poor growth, low survival and a delayed development and was considered to be inadequate for M. galloprovincialis larval culture. Rearing the larvae at 20 or 24 °C produced better growth, higher survival rates and faster metamorphosis as compared with 17 °C. The temperature region within 20 and 24 °C was suggested as adequate for the mussel M. galloprovincialis larval culture, and implications of these results on the development of commercial hatcheries were discussed.