罗非鱼链球菌病综合防控技术应用试验

<正>近年来,罗非鱼链球菌病爆发频繁,并呈现出发病鱼的规格越来越小、发病时间提前、发病面积增大、病死率高和损失大等特点[1]。对于罗非鱼链球菌病的预防与治疗诸多学者做了研究,如姚邵云[2]、吴山楠[3]、刘忠强[4]、刘志玲[5]等。为了健康有效的预防罗非鱼链球菌病,减少药物使用,降低养殖户的经济损失,该研究团队也对该病防治进行了研究。在总结前人成果,结合多年养殖和临床防治经验的     

罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立及应用

针对罗非鱼无乳链球菌Sip基因建立了LAMP检测方法,并对野外样本进行了无乳链球菌的调查研究。结果表明,目标Sip基因可在63℃40 min内被LAMP检测到,比PCR快约2 h,其DNA检测最低浓度为3.55×10~(-5) ng/μL,灵敏度比PCR高100倍,且对参考细菌无扩增。野外样品检测结果表明,运用LAMP检测技术对GBS的检出率为81.3%,比PCR高约20.0%。应用LAMP和PCR分别检测健康罗非鱼GBS检出率4.4%和2.2%,检测池塘水样品GBS检出率分别为10.0%和6.7%。     

常用水体初级生产力测定方法的结果差异分析

分析常用水体初级生产力测定方法所得结果之间的差异及原因,提高测定结果的可靠性,为基于水体初级生产力测定结果的科研及渔业生产实践提供参考依据。2014年7月、10月分别在同一水域,通过浮游植物生物量法、黑白瓶法、叶绿素a法同步测定水体初级生产力,将测定结果统一在C(碳)单位水平进行比较,结合分析其他不同营养水平水体初级生产力测定结果的差异。分析结果,水域为贫营养型水体,3种方法的测定结果均以叶绿素法测定结果最高,浮游植物生物量法次之,黑白瓶法最低。叶绿素法的测定结果平均比浮游植物生物量法高42.81%,比黑白瓶法高173.75%,浮游植物生物量法测定结果平均比黑白瓶法高91.68%。收集到的其他6种营养类型水域测得的水体初级生产力结果表现出与本研究相似的趋势,叶绿素法测定结果平均比浮游植物生物量法高40.28%,比黑白瓶法高171.38%,叶绿素法与黑白瓶法的初级生产力测定结果之比相近。影响水体初级生产力的因素复杂,为避免测定结果误差过大,可通过同步开展多种方法测定、重复测定、增加不同季节和不同环境条件下的测定,综合多种因素来选取合理值。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

水温和光照强度对乌原鲤耗氧率与临界窒息点的影响

[目的]探索水温和光照对乌原鲤耗氧率与临界窒息点的影响,为其人工繁育及规模化苗种培育提供参考依据.[方法]在密闭流水环境中,设3个水温梯度(14、19和24℃)和3个光照强度(<10、500~600和1200~1300 lx),通过测定进、出水样溶解氧含量而计算乌原鲤鱼种耗氧率和临界窒息点.[结果]乌原鲤鱼种耗氧率与临界窒息点在14~19℃范围内随水温的升高而增加,对应的平均耗氧率分别为0.19±0.07、0.22±0.06和0.29±0.07 mg/(g·h),临界窒息点则表现为24℃(1.5023 mg/L)>19℃(1.4887 mg/L)>14℃(1.2180 mg/L);乌原鲤鱼种耗氧率昼夜节律表现为:14℃水温条件下白天>晚上,19℃水温条件下晚上>白天,24℃水温条件下白天>晚上.在冬季水温(13℃)条件下,光照强度<10 lx时的乌原鲤鱼种平均耗氧率为0.15±0.06 mg/(g·h),光照强度为500~600 lx时的平均耗氧率为0.16±0.08 mg/(g·h),光照强度为1200~1300 lx时的平均耗氧率为0.16±0.07 mg/(g·h);对应的乌原鲤鱼种临界窒息点分别为1.7729、1.2316和1.1639 mg/L,乌原鲤临界窒息点与光照强度呈负相关,但组间差异不显著(P>0.05).[结论]在适宜生长水温范围内,乌原鲤耗氧率随水温的升高而增加,适当提高水温有利于促进其新陈代谢,提高生长速度;光照强度的变化对乌原鲤耗氧率与临界窒息点无明显影响,但黑暗条件下其临界窒息点较高.乌原鲤的高耗氧率和高临界窒息点直接限制其自然种群分布,也是造成其种群急剧减少的原因之一.     

凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA在毕赤酵母菌中的表达

[目的]明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA(LvcrustinA)在毕赤酵母菌中的表达情况,为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础.[方法]采用全基因合成法(PAS)合成LvcrustinA基因,然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα,所得重组质粒转化感受态细菌TOP10,以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转至毕赤酵母菌GS115;以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况,并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用.[结果]以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115,获得的重组菌株在30℃下摇床(220 r/min)培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA,且随培养时间的延长,其表达量逐渐增多.Western blotting鉴定结果显示,纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别.保护试验结果表明,融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力.[结论]利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA,且获得的LvcrustinA具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用.     

两个人工选择奥利亚罗非鱼群体系统发育 及其遗传多样性分析

[目的]了解人工选择偏好对奥利亚罗非鱼遗传多样性的影响,为今后人工选育及生产提供参考依据.[方法]对两个奥利亚罗非鱼群体(那马群体和武鸣群体)各70尾个体的线粒体DNA的D-loop区序列、CoI基因和Cytb基因进行测序及系统进化研究,并选用20对微卫星标记对其遗传多样性进行分析.[结果]基于D-loop区序列两个群体共检测出32个单倍型,其中共享单倍型6个;基于CoI基因共检测出23个单倍型,其中共享单倍型16个;基于Cytb基因共检测出14个单倍型,其中共享单倍型10个.基于D-loop区序列、CoI基因和Cytb基因单倍型分别构建的系统发育进化树显示,武鸣群体和那马群体的个体交错在一起,地理差异不明显,且采用NJ法和ME法构建系统发育进化树的进化拓扑结构基本相似.20对微卫星引物均能在奥利亚罗非鱼中获得稳定有效的扩增条带,其中有18个微卫星位点呈多态性;那马、武鸣群体的平均等位基因数(Na)分别为6.5000和7.9444,平均有效等位基因数(Ne)分别是3.9857和4.7268,平均观测杂合度(Ho)分别为0.7123和0.7752,平均期望杂合度(He)分别为0.9614和0.9711、平均Nei期望杂合度分别为0.7017和0.7636,均表现为武鸣群体略高于那马群体.两个群体的遗传分化系数(Fst)在不同微卫星位点间差异明显,其变化范围为0.0173(GM241)~0.2318(UNH868),平均0.0997;从单群体近交系数(Fis)和总群体近交系数(Fit)来看,所有微卫星位点的数值均为负值.[结论]经短期人工选择的武鸣群体奥利亚罗非鱼遗传多样性较被长期人工选择的那马群体遗传多样性丰富,即短期内的不同人工选择偏好对线粒体DNA的遗传影响较小.     

TLC-HPLC检测三黄连合剂的有效成分

[目的]以薄层色谱法-高效液相色谱法(TLC-HPLC)检测三黄连合剂的有效成分,为制定其质量标准及后期临床推广应用提供理论依据.[方法]采用TLC对三黄连合剂中的主要组分黄连、黄芩和连翘进行定性鉴别,并以HPLC对其主要有效成分黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷进行含量测定.[结果]三黄连合剂TLC色谱中的图像斑点清晰,与标准品对照斑点对齐,颜色一致.HPLC测定三黄连合剂中黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱分别在75.00~1200.00μg/mL(r=0.9997) 、4.17~66.67 μg/mL(r=0.9998)、9.38~150.00 μg/mL(r=0.9999)范围内线性关系良好,平均回收率分别为113.92%、100.18%和100.40%,其含量分别为5.03、0.25和0.27 mg/mL.[结论]TLC-HPLC可作为三黄连合剂的质量控制方法,且操作简便、重现性良好.