非洲猪瘟病毒感染后猪外周血淋巴细胞Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA分析

【目的】丰富非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染后猪外周血淋巴细胞长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）表达谱,并进一步挖掘影响Toll样受体信号通路的调控网络。【方法】试验动物感染ASFV,于第7天采集外周血并分离得到外周血淋巴细胞,运用Illumina高通量组学测序对外周血淋巴细胞中lncRNA进行测序,原始数据经处理后筛选获得差异表达的lncRNA,并进行靶基因预测,利用生物信息学方法对靶基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,初步绘制与Toll样受体信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络,并对lncRNA-ENSSSCG00000041959在内的4个lncRNAs进行实时荧光定量RT-PCR验证。【结果】共筛选到73个差异表达的lncRNAs,其中上调表达lncRNAs 38个,下调表达lncRNAs 35个。GO功能分析结果显示,靶基因显著富集在调节免疫系统过程、防御反应、生物刺激、病毒反应和先天性免疫;KEGG信号通路富集分析显示,大部分靶基因与细胞循环、疾病及免疫应答有关,其中免疫相关信号通路有Toll样受体信号通路、TNF信号通路、产生IgA的肠道免疫网络等。进一步挖掘出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的重要调控网络,实时荧光定量RT-PCR与测序结果一致。【结论】本研究初步鉴定出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,为进一步探索lncRNA调控ASFV感染机体免疫反应奠定了理论基础。     

羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达.以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化.SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性.间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s.经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑.分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好.作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.     

牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价

为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。     

猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。     

细粒棘球蚴Eg95s基因的串联表达及表达系统优化

为研制新型棘球蚴病基因工程疫苗,根据GenBank公布的细粒棘球蚴Eg95基因序列,针对其中一段348 bp高度亲水的优势表位序列设计引物,扩增Eg95s基因,利用同尾酶法基因同向串联方案,获得3拷贝Eg95s串联体。分别用两种表达载体pGEX-6p-1和pET-32a构建重组质粒,转化入3种大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)和Origami (DE3),对其进行IPTG诱导表达,经免疫印迹分析结果表明,均能正确表达具有免疫原性的Eg95s蛋白。通过重组蛋白的表达量、可溶性、纯化方法等方面的比较,对Eg95s重组表达系统的载体及宿主菌进行了优化,结果表明,3拷贝的串联Eg95s在以pET-32a为表达载体,Rosseta(DE3)为宿主菌的系统中表达最佳。最终获得了表达量高、可溶性好、纯化方便的Eg95s重组蛋白表达系统,为大规模生产棘球蚴病基因工程疫苗提供了科学依据。     

体外筛选对鸡具有免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸

分别用有丝分裂原和CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对SPF鸡全血，经低速离心分离的外周血单个核细胞(PBMC)和脾脏细胞，用淋巴细胞分离液分离的PBMC和脾脏细胞进行刺激，用^3H-TdR掺入法测定并比较上述鸡免疫细胞在不同培养温度和细胞浓度下的转化效果，从而建立了适用于大批量筛选对鸡具有免疫刺激活性CpG ODN的淋巴细胞转化方法。进一步用该方法筛选自行设计合成的38条ODN.结果表明，用低速离心法分离的鸡PBMC，在细胞含量为10^7mL^-1、37℃、5％CO2条件下，经CpG ODN刺激64～66h后，可以得到稳定的高效转化；不含CpG模体的ODN不具有免疫刺激活性；CpG ODN 10、11和14具有最佳的免疫刺激活性，刺激指数大于10。     

山羊抗鸡法氏囊病高免血清的研制和应用

目前防治鸡法氏囊病(IBD)最有效的生物制品是抗法氏囊病高免血清(IBDS)。利用康复鸡或免疫鸡制备抗IBDS已广泛应用于临床。为了增加产量,降低成本,近年来我们进行了山羊抗IBDS的研制,效果良好,报告如下。     

犬瘟热病毒BJ16B2株的分离鉴定及H基因遗传进化分析

采用Vero/SLAM细胞,从疑似犬瘟热病毒(CDV)感染犬的眼鼻分泌物拭子中分离到1株病毒,经细胞病变(CPE)观察、RT-PCR检测和间接免疫荧光试验鉴定,确定该分离株为CDV,命名为BJ16B2。对其H基因进行克隆和测序分析,BJ16B2株属于Asia-1型;潜在N-糖基化位点分析,共有9个位点,且在309~311位点,为强毒株。同源性比对分析发现,BJ16B2与参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.7%~99.5%和86.5%~99.5%。其中与Asia-1型SY株同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性均为99.5%,与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac以及Onderstepoort亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.6%~91.1%和90.3%~91.4%。强毒株BJ16B2的成功分离以及对其H基因序列分析,有利于进一步了解当前中国CDV流行株变异情况,为CDV毒力变化和宿主嗜性的研究提供参考依据。     

IP-10作为牛结核病诊断标志物的初步探究

为评价细胞因子IL-12 p40、IP-10和TNF-α转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。采集田间筛选的结核病阳性牛、结核病阴性牛以及牛分枝杆菌68002人工感染牛的外周血淋巴细胞,经牛结核菌素(PPDB)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、MPT63、PET和PBS分别刺激6 h,提取细胞总RNA,用荧光定量PCR检测IL-12 p40、IP-10、IFN-γ和TNF-α的转录水平。结果显示结核病阳性牛的外周血淋巴细胞经PPDB和CE刺激后,其IP-10的m RNA转录水平显著高于结核病阴性牛,且与IFN-γ的m RNA转录水平具有良好的相关性;初步建立牛结核病IFN-γ和IP-10的Real-time PCR检测方法,其对临床阳性样本的检出率分别为71.45%和78.57%。因此,IP-10的m RNA转录水平与牛分枝杆菌的感染相关,有作为牛结核病诊断标志物的潜力。