鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

贝类折光马尔太虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Genbank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的半套式PCR方法.该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与实验设计相符的228 bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.01 fg的折光马尔太虫质粒DNA.用该半套式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫7份,结果提示福建沿海养殖的贝类中存在折光马尔太虫感染,建立的半套式PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测.     

贝类折光马尔太虫LAMP可视化检测方法的建立

根据折光马尔太虫的基因保守序列设计了1套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了折光马尔太虫LAMP可视化检测方法。该方法全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;检测的灵感性可达20fg,高于常规PCR方法100倍;对其他贝类常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明,所建立的折光马尔太虫LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异,可用于贝类折光马尔太虫感染的快速检测。     

牛轮状病毒二温式PCR检测方法的建立

根据牛轮状病毒（Bovine rotavrius,BRV）的群特异性基因VP6设计了1对特异引物,建立并优化了能够快速检测BRV的二温式PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,该二温式PCR只对BRV敏感,可扩增获得大小为385 bp的特异性条带,其敏感性为最低能检测到1 pg的BRV RNA;而对其他病毒不敏感。说明所建立的BRV二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌灭活菌苗免疫保护及药物治疗试验

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌培养物经甲醛灭活后,制成灭活油乳剂苗、灭活菌苗、饵料吸附型疫苗,免疫罗非鱼2周后,分别以嗜水气单胞菌、爱德华氏菌活菌液攻毒,结果显示,注射型疫苗均优于口服型,其中嗜水气单胞菌以腹腔注射0．1mL嗜水气单胞菌灭活菌苗＋0．3mL生理盐水的效果最佳,免疫保护率为85．0％;而爱德华氏菌以腹腔注射0．4mL灭活油乳剂苗效果最佳,免疫保护率为90．0％。两者的药物治疗试验结果显示,以氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸治疗罗非鱼嗜水气单胞菌病、爱德华氏菌病均有一定效果,对减少发病率及死亡率、控制病情具有较好作用,其中以氟苯尼考的疗效最佳,其用量为20mg／kgH2O。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基因在毕赤酵母中的表达与分析

构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxIA基因的真核表达载体pPICZαA/apxI,并在毕赤酵母GS115中进行表达。SDS-PAGE显示仅在浓缩40倍的上清中检测得到表达产物,同时经RT-PCR可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,经分析发现目的序列AT含量高达62%,其中含49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。证实ApxIA在毕赤酵母中为低水平表达。     

多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点，设计合成了二对引物XZ1，XZ2和XZ45、XZ46，建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明，用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR，强毒株只扩增出732bp一条带，而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带，而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带，结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体(MG)、滑液囊霉形体(MS)、衣阿华霉形体(MI)和火鸡霉形体(MM)的基因文库，设计了4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物，用这4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果，均同时得到了4条特异性的大小与试验设计相符的732bp(MG)、207bp(MS)、299bp(MI)、850bp(MM)多重PCR扩增带，而对其他6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，此多重PCR能同时检出1pg的MG、MS、MI和MM DNA模板。     

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。