禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%.该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血孤菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性.用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%.结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测.     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

鸭 I 型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法.该方法对同一样品中的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的202 bp(鸭I型肝炎病毒)和474 bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到100 fg的鸭I型肝炎病毒RNA和番鸭细小病毒DNA.研究建立的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测.     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.     

鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒 三重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix Taq~(TM)12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

贝类派琴虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的派琴虫质粒DNA。用该半套式PCR对临床样品进行检测,结果表明广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州溢蛏存在派琴虫感染,说明建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。