Research on Antimicrobial Resistance Characteristics of Enterococcus spp. from Companion Animals in Beijing

In order to study the tolerance of Enterococcus spp.from companion animals to common antibiotics in Beijing,320 samples were collected from dogs and cats in a pet hospital in Beijing from May 2015 to January 2016.The strains were isolated by selective culture medium and identified by VITEK-2 Compact 60.The sensitivity test of 11 kinds of common antibiotics in 8 categories was carried out for the isolated and identified strains.At the same time,the high-level gentamicin and high-level streptomycin resistance test were carried out to analyze the drug resistance and multiple drug resistance of Enterococcus.A total of 318 strains of non repetitive enterococci with different colony morphology and biochemical characteristics were obtained.The isolation rates of Enterococcus faecalis (49.06%) and Enterococcus faecium (29.87%) were higher.The resistance rates of Enterococcus to high-level gentamicin and high-level streptomycin were 39.94% and 43.40%,respectively.The resistance rates to tetracycline (78.62%),erythromycin (67.30%) and quinoproptin dapfoptin (43.71%) were very high.All of them were sensitive to tigecycline,and the non-resistant rate to vancomycin and nitrofurantoin was also high (98.74%).Enterococcus tested showed different degrees of resistance to class 1 to class 7 antibiotics,and the multidrug resistance was common,and the multidrug resistance rate was as high as 57.23%.The number of resistant antibiotics was the highest (n=65).A total of 44 different drug resistance profiles were obtained.Among them,erythromycin-quinoptin-daptoptin-tetracycline-high level aminoglycoside resistant spectrum accounted for the highest proportion (45/318,14.15%).This study confirmed that Enterococcus spp.isolated from companion animals in Beijing was highly resistant to common antibiotics,and multidrug resistance was prevalent.Therefore,it was necessary to strengthen the monitoring of drug resistance.     

微量环丙沙星对人源大肠杆菌和粪肠球菌体外敏感性的影响

建立人离体肠道模拟模型，研究微量环丙沙星对人源肠道大肠杆菌和粪肠球菌敏感性的影响，进而用聚合酶链反应法扩增耐药菌的gyrA基因的耐药决定区，并分析其耐药机制。结果显示，大肠杆菌连续培养后存活菌株对微量环丙沙星耐药，此耐药菌对其他抗菌药敏感；粪肠球菌绎连续培养，对环丙沙星和其他抗菌药物仍敏感；耐药大肠杆菌的gyrA基因发生突变，248位碱基由C变为T，259位由G变为T，相应地，该基因编码的蛋白质在83位的丝氨酸和87位的天冬氨酸分别改变为亮氨酸和酪氨酸。研究表明，微量环丙沙星对人肠道菌群具有不同的选择作用，能诱导大肠杆菌产生耐药性。这为动物源食品中环丙沙星残留的安全性评价提供了试验依据。     

猪源粪肠球菌的基因型及耐药性分析

为了解上海地区规模化猪场中粪肠球菌的耐药性和基因型,2013年3月-2014年5月从上海地区10个规模化养猪场收集到分离鉴定的粪肠球菌133株,采用微量肉汤稀释法对12种抗菌药物进行药敏试验,采用PCR技术分别检测分离株中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类抗生素耐药相关基因[aac(6’)/aph(2")和aph(3’)-Ⅲ和ant(6)-Ⅰ]、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(ermB和mefA)和万古霉素耐药相关基因(vanA和vanB)。结果显示,在133株粪肠球菌中,耐药基因ermB、tetM、TEM、ant(6)-Ⅰ、aac(6’)/aph2"、aph(3’)-Ⅲ、vanA的检出率分别为:95.5%(127/133)、91.0%(121/133)、63.2%(84/133)、45.9%(61/133)、42.1%(56/133)、24.1%(32/133)、3.0%(4/133);未检出mefA和vanB基因的菌株。分离菌株对12种抗菌药物的耐药性较为严重,且以6~9耐为主要耐药株,占81.2%。试验表明,上海地区猪源粪肠球菌多重耐药现象严重,携带抗菌药物相关耐药基因是导致分离株耐药的主要原因。     

动物源肠球菌对饲用抗菌促生长剂流行病学临界值的建立

【目的】建立动物源肠球菌对抗菌促生长剂的流行病学临界值,并基于此了解2019-2021年动物源肠球菌对饲用抗菌促生长剂的耐药情况。【方法】测定2019-2021年从北京、河北、四川、山西、陕西和内蒙古养殖场动物样本中分离得到的肠球菌对7种抗菌促生长剂（吉他霉素、黄霉素、恩拉霉素、那西肽、阿维拉霉素、维吉尼亚霉素和杆菌肽）的最小抑菌浓度（MIC）值。根据CLSI-VET中规定的方法,利用统计软件ECOFFinder对MIC分布数据进行非线性回归模拟,以95%置信区间下的流行病学临界值计算动物源肠球菌对7种抗菌促生长剂的耐药率。【结果】确定了动物源肠球菌对吉他霉素、黄霉素、恩拉霉素、那西肽、阿维拉霉素、维吉尼亚霉素和杆菌肽的流行病学临界值分别为8、8、8、0.25、8、8和32 μg/mL。由此计算的药物耐药率为64.38%、34.48%、80.06%、14.69%、19.06%、50.69%和24.96%,其中动物源肠球菌对恩拉霉素、吉他霉素和维吉尼亚霉素的耐药情况最为严重,而对那西肽最敏感。在2019-2021年的耐药率变化情况统计中,黄霉素和杆菌肽的耐药率下降趋势较为明显。【结论】本研究制定了动物源肠球菌对7种养殖业常用抗菌促生长剂的流行病学临界值,可作为动物源肠球菌对饲用抗菌促生长剂敏感和耐药的初步判定标准,为进一步制定耐药折点,监测动物源肠球菌对抗菌促生长剂的耐药情况变化提供数据基础和科学依据。     

壳寡糖与屎肠球菌对肉仔鸡生长性能、免疫功能及肠道短链脂肪酸含量的影响

本试验旨在探究饲粮中添加壳寡糖(COS)和鸡源屎肠球菌PNC01(PNC)对脂多糖(LPS)诱导的肉鸡炎症反应的调节作用。选取1日龄健康且体重相近的AA公雏560羽,采用2(LPS刺激/非LPS刺激)×2(添加COS/不添加COS)×2(添加PNC/不添加PNC)三因素试验设计,共8个处理,每处理7重复,每重复10只鸡,试验期21 d。采用玉米-豆粕型基础饲粮,试验饲粮分别在基础日粮基础上添加COS(200 mg/kg)和PNC(1×10~9 CFU/kg)。于试验第17、19、21天,刺激组腹腔注射LPS(1 mg/kg体重),对照组注射等量生理盐水。结果表明:LPS刺激降低肉鸡采食量(P<0.01),破坏肠道形态,降低盲肠食糜中丁酸含量和血清IgA水平(P<0.05),引起脾脏肿大,上调IL-1β和IL-8 mRNA表达(P<0.01);添加COS缓解LPS刺激肉鸡采食量的下降(P<0.05),提高盲肠丙酸和丁酸含量(P<0.05),COS降低脾脏指数和回肠IL-8mRNA表达量(P<0.05),有下调脾脏IL-1βmRNA表达的趋势(P<0.1);PNC可提高21 d肉鸡血清IgA含量(P<0.05),降低肉仔鸡脾脏指数(P<0.01);非LPS刺激时,同时添加COS和PNC可提高盲肠中乙酸含量(P<0.05)。可见,添加COS和PNC均能缓解LPS刺激导致的脾脏肿大,缓解炎症反应,改善LPS刺激对肉仔鸡的不利影响。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。     

猪源肠球菌明胶液化表型与5种毒力基因的检测分析

为探究明胶液化的表型与其5种毒力基因在不同来源和不同种属猪肠球菌中的分布差异,本研究采用PCR方法以及明胶液化试验对湖南分离的375株肠球菌携带的明胶酶基因(gelE)、调控gelE表达的毒力基因反应调节子基因(fsrA)、前肽加工蛋白基因(fsrB)、组氨酸激酶基因(fsrC)、丝氨酸蛋白酶基因(sprE)共5种毒力基因的分布情况以及液化明胶现象进行检测。结果显示,共263株肠球菌检测到了毒力基因,检出率分别为41.3%(gelE)、45.9%(fsrA)、50.9%(fsrB)、48.8%(fsrC)、48.8%(sprE)。能够同时检测到5种毒力基因的菌株共有110株,其中粪肠球菌106株,且该5种毒力基因在106株粪肠球菌中的检出率均为最高,另外4株为其它肠球菌。在明胶液化试验中,共有155株肠球菌检测到gelE基因,但只有106株能够发生明胶液化现象,且这些菌株正是能够同时检测到5种毒力基因的106株粪肠球菌,而另外4株能够同时检测到5种毒力基因的其它肠球菌却不能发生明胶液化现象。结果表明,粪肠球菌是肠球菌中主要携带毒力基因的菌属,与屎肠球菌以及其它肠球菌相比,更容易出现液化明胶的表型,这可能与粪肠球菌中某些明胶液化的机制有关,且除gelE外,参与gelE表达的几种毒力基因对该表型的出现也具有一定的影响。     

3种不同水源粪肠球菌耐药情况

为了解水环境中粪肠球菌对常用抗生素的耐药情况,从某校鱼塘、污水沟和模型池塘中共分离出99株粪肠球菌,采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法进行药敏试验.结果显示:污水沟分离菌的耐药率最高,其中红霉素、土霉素、环丙沙星、氯霉素和氨苄西林的耐药率分别为89.3%、89.3%、82.1%、46.4%和32.1%,且多数对3-5种抗生素多重耐药;其次为鱼塘分离菌,耐药谱多为对1-2种抗生素同时耐药;模型池塘分离敏感菌较多;3处均未分离出万古霉素耐药粪肠球菌.提示不同水源粪肠球菌耐药情况与水源受抗生素污染程度存在联系,表明细菌耐药性监测及环境保护的重要性.     

屎肠球菌对感染柔嫩艾美耳球虫肉鸡生长性能和肠道屏障的影响

旨在探究屎肠球菌(Enterococcus foecium)对人工感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)肉鸡生长性能、存活率、盲肠损伤、粪便卵囊排出和肠道屏障功能的影响.选取体重相近的1日龄肉鸡(罗斯308)180羽,随机分为5组,包括空白对照组(NC)、感染对照组(PC)、70 mg·kg-1盐霉素添加组...     

致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05 LuxS 基因的克隆与原核表达

采用 PCR 技术从致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05基因组中扩增得到 LuxS 基因的全序列,对其进行分析,同时与其他细菌相应基因序列及编码的氨基酸进行同源性分析;构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行鉴定。结果显示,该粪肠球菌 XJ05的 LuxS 基因全长459 bp,编码152个氨基酸,具有功能序列HXXEH,核苷酸同源性与 GenBank 上的枯草芽胞杆菌和粪肠球菌 V583同源性最高,分别为61．2％和100％;构建的重组质粒经诱导后表达分子质量为20 ku 的蛋白质,Western blot 检测显示特异性条带。说明 XJ05的 luxS 基因与肠球菌 V583和枯草芽胞杆菌亲缘关系较近,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。